使用 DNase I 处理悬浮细胞团块

制备单细胞悬液对细胞分离是否成功至为关键。使用含有细胞团块的样本进行细胞分离会导致细胞回收率降低，并且可能会影响正确的靶细胞标记。 

当样本被反复冻融或者使用酶分解组织时，样本有时会呈现「团块状」。这是因为外界压力加速细胞死亡，从死细胞中释放出来的「粘性」DNA 分子将邻近的细胞粘合在一起，因此产生了细胞团块。 

在样本中加入脱氧核糖核酸内切酶 I（DNase I）可以减少 DNA 悬浮碎片和细胞团块。现今有许多使用 DNase I 以减少细胞团块的有效操作方法。我们推荐在细胞悬液中加入 DNase I 溶液（ 产品编号 #07900）至终浓度为 0.1 mg/mL（或者 200 Kunitz units/mL），并在室温孵育 15 分钟之后进行下游应用。 

下面的复苏冷冻样本的方法描述了使用 DNase I 制备单细胞悬液和减少细胞团块的操作步骤： 

1. 在 37 °C 水浴中快速旋冻存管。将解冻的细胞转入一个灭菌过的 50 mL 圆锥管。 可选择：在圆锥管中加入 0.25 到 0.5 mL 初浓度为 1 mg/mL DNase I 溶液，然后再将解冻的细胞 转入管中。

2. 用 1 mL 含 10% FBS 的培养基或缓冲液（例如 PBS 或者 HBSS）冲洗冻存管，以收集管中残留的细胞，然后将培养基或缓冲液转移到新的试管中。

3. 缓慢逐滴加入 10～15 mL 的含 10% FBS 的培养基或缓冲液，同时缓慢摇动试管混匀。

4. 用含 10% FBS 的培养基或缓冲液补满 50 mL 试管。

5. 室温离心， 300 x g；10 分钟来收集细胞（G 到 RPM 转换工具）。

6. 小心地弃去尽可能多的上清液，尽量不要搅动细胞沉淀。轻轻拍打管壁来重新悬浮沉淀。

7. 如果细胞悬液看上去混浊，计算达到终浓度为 0.1 mg/mL 所需的 DNase I，逐滴加入 DNase I 并同时缓慢摇动试管混匀。在室温下孵育 15 分钟。

8. 加入 25 mL 含 2% FBS 的培养基或缓冲液，轻轻倒置试管混匀然后离心（转速和时间与上面的步骤相同）。弃去尽可能多的上清液然后重新温和地悬浮沉淀。

9. 如果细胞悬液看上去仍然混浊，使用一个 30～70 µm 的细胞滤网过滤样本并移入新的试管中。使用含 2% FBS 的培养基或缓冲液洗涤试管，然后使用细胞滤网过滤， 重复三次。

10. 得到的细胞悬液可以进行细胞计数和之后的下游应用，例如细胞分选。

请注意：如果是对 DNase 比较敏感的下游应用 （例如造血细胞集落检测），进行细胞计数前再使用恰当的检测缓冲液洗涤细胞一次。 

如需要更多帮助和资讯，请与我们联系 info.cn@stemcell.com。

编辑： z翟某某    来源：丁香园