CRISPR/Cas9 系统
基因组编辑是指早期遗传工程技术的生物技术的新兴分支。 通过使用这些生物技术,研究人员能够靶向特定的 DNA 序列诱导双链断裂,利用重组来产生宿主的合成遗传基因组。
CRISPR 序列及其 Cas(CRISPR 相关)基因编码适应性免疫系统,保护细菌和古细菌免受病毒(噬菌体)和质粒感染。RNA 指导的 DNA 内切核酸酶 Cas9 与双重 RNA 指导(CRISPR RNA [crRNA])和反式激活 RNA [tracrRNA] 或合成单指导 RNA(sgRNA)缔合,并切割双链 DNA 指导 RNA 互补的序列。双链断裂发生在 PAM 位点上游 3bp 处,允许通过两个 DNA 修复途径进行靶向序列修饰:引入移码插入和缺失突变的非同源末端连接(NHEJ),导致功能丧失等位基因和同源定向修复(HDR),用于在靶基因序列处精确插入点突变或期望序列的片段。目前,CRISPR-Cas9 系统已应用于多种模式生物,包括人,小鼠,大鼠,斑马鱼,线虫,植物和细菌。
CRISPR/Cas9 技术优势
▶ 简单快速设计靶点
▶ Knock-out 和 knock-in 可以建立细胞系
▶ RNA 指导的基因组 DNA 特异性识别不需要考虑 DNA 甲基化
▶ CRISPR/Cas9 慢病毒系统可以感染分裂和非分裂细胞
▶ 靶点操作高效灵活. 多个基因可以同时编辑,基因的修饰可以是遗传的
▶ CRISPR 能应用于多种种属细胞
▶ CRISPR 与 ZFN 和 TALEN 相比具有相同或高效的基因编辑
一站式 CRISPR/Cas9 服务
CRISPR/Cas9:基因敲除细胞系构建服务
• gRNA 设计、合成及构建
• 病毒制备(针对慢病毒载体)
• 转染
• 单克隆制备及细胞建库
• 鉴定(可选)
CRISPR/Cas9:基因敲入细胞系构建服务
• gRNA 设计、合成及构建
• 转染
• 单克隆制备及细胞建库
• 鉴定(可选)
gRNA 质粒构建服务
• gRNA 设计、合成及构建
• 载体构建
一站式 CRISPR/Cas9 基因组编辑服务流程图
细胞预培养及选择转染方法 | → | gRNA 设计:构建及制备质粒 | → | 转染:将 gRNA 和 cas9(以及用于 Knock-in 实验的供体质粒)转染细胞 | → | 细胞池分析:PCR 及测序分析 Knock-out 或 Knock-in 细胞 | → | 单克隆生成 | → | 单细胞克隆测序筛选及细胞冻存 | → | 最终结果:单细胞克隆及详细报告 |