蛋白制胶、电泳、转印速度大革命-见证奇迹

Western blot结果中背景高且不均匀

   2013-10-18
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可能原因 建   议
1、抗体浓度太高 一抗或二抗浓度太高会导致高背景,降低抗体浓度
2、使用的封闭液不兼容 对比不同的封闭缓冲液
3、非特异性位点封闭不足 优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性
提高封闭液中蛋白的浓度
优化封闭时间和/或温度。室温封闭至少1 h或者4°C封闭过夜
在封闭液中加入Tween-20,Tween-20的终浓度为0.05%
4、封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 换一种不同的封闭液
不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素
交叉反应的检测。封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测
5、洗涤不充分,增加洗涤次数和使用缓冲液的体积 降低HRP结合物的浓度
如果洗涤液中无Tween-20,添加Tween-20使其终浓度为0.05%
6、膜的曝光时间过久 缩短印迹膜曝光到胶片的时间
按照说明书的指示,保证膜始终是湿润的
用一张新膜
保证膜完全被液体覆盖,避免其干燥
在孵育过程中始终进行震荡
小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合
不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子
7、缓冲液污染或结块沉淀 制备新的缓冲液
8、抗体浓度太高 若一抗和/或二抗浓度过高会产生高背景,降低抗体浓度
9、HRP处产生聚集体 用0.2 μm过滤器过滤结合物
10、结合可产生斑点 用一种新的高质量的结合物
11、缓冲液中有污染 使用新的缓冲液
缓冲液使用前过滤
12、操作设备被污染 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物
保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景

 

编辑: snail    来源:丁香园

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