ELISA 实验通关必备

（一）ELISA 基础知识

▶ ELISA = Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ：酶联免疫吸附检测，利用抗原抗体的特异性反应，对样本中可溶性目的产物进行定量检测

▶ ELISA 与常规免疫实验对比

ELISA 特点：样本制备简单；灵敏度高（pg/ml）；特异性强；重复性好；操作简单；检测仪器易获得（酶标仪）。

▶ ELISA 种类

▶ 各种 ELISA 特点

▶ ELISA 应用场景

（二）8 大质控指标

▶ 回收率：将已知的低、中、高浓度的重组蛋白掺入到待测样本中，掺入前后测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，以此验证检测的准确度。复杂的样本基质，如血清、血浆中可能含有干扰因子，影响准确定量目标分析物。优秀的 ELISA 试剂盒回收率通常在 80-120% 之间（视为无可计量的基质干扰），合格试剂盒在 60% 左右

▶  稀释线性：样本稀释后，最终分析物浓度应该相同，这个就是公认的实验线性。干扰因子会影响实验的线性，除非在研发环节克服这些干扰效应。我们为每个验证过的样本类型用试剂自带的稀释液进行系列稀释。结果用检测值和理论值的百分比表示，线性介于 80-120% 为理想结果

▶  精密度：在相同条件下，对被测量物 (高、中、低浓度) 进行多次反复测量，测得值之间的一致（符合）程度。这一特性具有重要意义：1）保证一项试验中得到的结果是准确的，并且一次实验到下一次实验结果可重复；2）判定两个结果相同还是不同。通常用变异系数（coefficient of variation, CV）来表示。

优秀 ELISA 试剂盒的酶标板内变异系数（CV）小于 5%，酶标板间变异系数小于 8%；我们每个说明书会注明板内和板间 CV 值。 我们的板内变异＜5%；酶标板间变异＜8%。

▶ 校准：校准确保批次间一致性。联科生物标准品质量是通过与母校准品进行比较而制定。用于保证不同批次间试剂盒的一致性，所有批次的试剂盒均经过母校准品校对，不会出现结果偏差。标准品质量的制定是根据 ELISA 试剂盒设定，不同厂商的试剂不能直接用于其他厂商的试剂盒，对于存在 WHO 国际参考材料的产品，联科生物提供转换的相关系数。

▶  特异性：抗体是特异的, 只与相应抗原反应。实际制备的抗体却常有非特异性反应，这是因为抗原不纯造成的。多组分抗原之间存在共同的抗原决定簇，或者两个抗原决定簇结构类似能与同一抗体结合，均可出现抗体与异源抗原的交叉反应。联科生物每个指标都进行了特异性分析，排除主要因子和近源

▶  灵敏度，稳定性，样本值

联科生物每个指标的 ELISA 试剂盒都进行了灵敏度，稳定性，样本值的检测。稳定性检测：4℃，Kit ≥ 18 月

（三）ELISA 实验步骤

▶ ELISA 简要步骤（双抗体夹心法）

（四）ELISA 操作注意事项

▶ 试剂盒使用前室温平衡 20-30 分钟。温度是 ELISA 结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致 ELISA 检测结果的不准确。若无该过程，可能导致一些弱阳性样本出现假阴性。

▶ 样本不能反复冻融，不能有严重溶血现象。样本反复冻融对蛋白影响非常大，易导致蛋白降解；一般来说血清/血浆（蛋白含量丰富）样本冻融 1-2 次，影响不大；但是其他样本类型，比如细胞上清/肺泡灌洗液，冻融 1-2 次后，蛋白降解严重，不适合再用于 ELISA。血清/血浆样本若溶血不严重（浅红色），仍可做 ELISA 检测，建议适当增加洗板次数，减少背景过高影响；若溶血严重（深红色），建议重新取样。

▶ 标准品、样品均做复孔：复孔的目的在于计算检测结果平均值，使实验结果更准确；通过复孔结果对比，评估试剂盒的精密度及实验中是否存在误操作；

▶  规范加样，捕获抗体吸附于微孔内壁，加样时，枪头不能碰触内壁。不规范的移液操作可能带来 0.1% 到 5% 的移液误差，甚至更高！移液器定期校准，选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上，不可产生气泡；加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；如果加样枪漏气以至于加样的量不够，不能用枪吸出再加，做相应记录实验；每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。

▶  每次实验，必须做标准曲线。反应温度，时间，加样操作都会影响实验结果，所以必须每次实验都同时做标曲。

▶  标准品严格按说明书要求溶解。粉末标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。根据瓶标签加入一定体积的蒸馏水 (或说明书指定溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置溶解 10-30 分钟，让粉末完全溶解。注意：加水 (或说明书指定溶液）后暂不用移液枪吹吸，避免蛋白未溶解，枪头带出部分蛋白，待完全溶解后可吹吸或涡旋振荡混匀。

▶  严格控制反应温度和反应时间。抗原抗体的结合反应以及后续的酶促反应，都受反应温度和反应时间的影响。每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。

▶  孵育环节务必使用微孔板振荡器。孵育过程震荡，可以加快、加强抗原抗体之间的相互碰撞接触，使得反应更加完全，OD 值通常比未震荡孵育的结果要高。

▶  洗板次数，洗板液的量，洗板液浸泡时间的长短，按说明书操作。建议按照说明书操作，每次洗涤至少洗液浸泡 30s，重复 6 次，洗板时间太短、次数太少会导致实验效果不佳，延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被杂物堵塞可用注射器针头挑出。扣干后的酶标板应立即加液，不能干板太久。

▶  显色判断：说明书中提供的显色时间仅为经验，具体时间需随时注意观察。通常最高浓度的标准品颜色不再变深，S1、S2、S3 有明显梯度，S5 有淡蓝色，或者标准品 S1 孔在 630 nm 的 OD 值在 0.5-0.7、S5 孔的 OD 值达到 0.05-0.08，可以终止反应。

▶  检测：酶标仪使用前务必预热 10-15 分钟，使结果更稳定；采用双波长测定吸光值，排除单波长检测时的测定干扰（样本的干扰、干扰色等）。一般采用最大波长为参考波长，在参考波长 630 nm(570 nm) 下，检测物的吸光值最小，检测波长 450 nm 和参考波长 630 nm(570 nm) 的吸光值之差可以消除非特异性吸收，双波长测定，可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。 

（五）标注曲线拟合

标准品浓度和相应的吸光度（OD）值如果能够呈现直线关系是最理想的，这时可以通过 Excel 等方便的获得拟合曲线，进而推算出样品的浓度值。但我们做免疫检测很少能够有这么理想的情况，标品浓度和相应 OD 值往往是 "S" 型的曲线关系，这时就不能用直线拟合的方式了，而对拟合方法进行选择就是必要的了。

关于标准曲线的拟合方式，直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于 ELISA 及其它生物学反应中的曲线拟合，但都只适用于曲线的一部分，有的适用于前半段，有的适用于后半段，有的适用于中间一段，而 Logistic 曲线则对曲线的全部都有较好的适用性。当然，如果用于定量，还是在中间一段较好。这些方法虽然没有一种方法可以通用，但也都可以用。关键在于你的标准曲线做到了 S 形的哪一部分，你想检测的样品浓度在曲线的哪一部分。在 S 曲线的低浓度部分可以用乘幂方程很好的拟合，中低浓度部分可以用直线方程，中间部分可用对数方程，而中后段可用四参数。

目前国际上最流行的免疫检测拟合方式是「四参数逻辑拟合」，用这种拟合方式往往能够比较精确的反映浓度和吸光度的曲线关系，从而进一步比较正确的获得样品中待测物质的浓度值。

其实，在一个长的区间内，Logistic 应该都能拟合得较为理想。但并不是说它就是万能的。事实上不仅是 ELISA，其它很多生物学反应都是 S 形曲线，也都可以用 Logistic 曲线拟合。但建模型是一回事，而用它来定量是另一回事。如果用来定量，S 形曲线的中间段（较陡处）是比较好的，而两端的平坦部分计算误差会大，有时甚至会很大。

编辑： zhuq    来源：丁香园