CRISPR/Cas9 基因编辑中的「超级剪刀」

从 DNA 结构的发现使得人们初步认识基因结构，到 PCR 技术的出现实现基因的体外扩增，再到基于 PCR 技术的基因测序技术使人们第一次看到了人类基因组库的信息全貌。但是无论基因操作技术如何发展，都改变不了人们对基因编辑技术的狂热追求，因为他直接关系到人类疾病的诊断和治疗、优生优育以及人种的进化。  基因编辑技术大致经历了 3 个发展阶段，以「锌指核酸内切酶（ZFN）」、「类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）」为代表的第一、二代技术以及以 CRISPR/Cas9 为代表的源于细菌一种获得性免疫系统的三代技术。CRISPR/Cas9 技术相比前两代技术，具有成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室。近年来应用 CRISPR/Cas9 技术发表的高水平文章达到了 10000 余篇，该技术也是目前唯一被验证可应用于临床治疗的基因编辑技术，被誉为「基因超级剪刀」。

云克隆一直致力于基因编辑技术的开发和研究，有 CRISPR/Cas9 技术平台及与之配套的慢病毒和腺病毒转染平台技术体系。CRISPR/Cas9 基因编辑载体包含 Cas9 表达元件、sgRNA 转录元件、筛选标记元件、原核复制元件等，导致转染质粒偏大，采用传统瞬时转染技术转染效率不高，而且效果不稳定，难以达到预期目的,  但慢病毒和腺病毒转染系统能很好的解决这个问题。慢病毒和腺病毒转染系统中的病毒株系均采用可感染哺乳动物细胞的病毒改造而来，从而使他们变成了一个很好的基因载体，通过筛选重组病毒并进行富集，便可直接用于侵染目的细胞。在重组病毒对目的细胞进行侵染的过程中，CRISPR/Cas9 结构就会随着重组病毒基因组一并进入到目的细胞中（如图 1 所示）。通过这个侵染过程，一方面保证了目的片段对目标细胞的转染效率，另一方面借助病毒的表达原件实现了 Cas9 和 sgRNA 的高效表达和转录，以保证对目的细胞基因组特定位点的高效剪切（如图 2 所示）。

我们采用慢病毒转染和 CRISPR/Cas9 技术相结合，对 MCF-7 细胞 BECN1 基因进行定点编辑。首先我们选择人 BECN1 基因的两个外显子区域中三个 23 碱基构成的 CRISPR/Cas9 靶序列（N20NGG）（如图 3 所示），通过化学合成方法得到 20nt 的 guide 序列及其互补序列，sgRNA 及其互补序列退火形成双链，借助 BsmBI 单酶切和酶连构建含有 sgRNA 序列信息的 LentiCRISPRv2 重组载体（如图 4 所示），LentiCRISPRv2 中含有 CRISPR/Cas9 全部组件以及慢病毒的核心组件；接着 LentiCRISPRv2 重组载体和慢病毒的包装质粒共同转染 293T 细胞，在已共同转染的 293T 细胞内慢病毒自我包装形成具有感染性的病毒颗粒，这些病毒颗粒基因组中也会包含 CRISPR/Cas9 的全部组件。收集病毒颗粒直接侵染 MCF-7 细胞株，重组病毒基因组会插入 MCF-7 细胞基因组中，通过嘌呤霉素筛选，最终获取稳定转染的 MCF-7 细胞株。在稳定转染的 MCF-7 细胞株内，Cas9 和 sgRNA 能够被稳定表达和转录，进而结合成剪切复合体，复合体被转运进入细胞核，以完成对 sgRNA 互补 DNA 片段的剪切，到达对目的片段定向剪切目的（如图 5 所示）。

对于基因敲除效果在蛋白水平的表现，我们通过 WB 做了进一步的验证，直接选取筛选过的细胞作为验证对象，通过 WB 技术半定量检测了 BECN1 蛋白的含量。检测结果如图 6 所示，选取的三个 sgRNA 都对 MCF-7 细胞的 BECN1 基因产生的重新的编辑，通过人为创造的移码突变使得 BECN1 蛋白的含量出现了显著性的下调。

CRISPR/Cas9 技术目前被广泛的应用于基因敲除或基因敲入细胞系和动物的制备，以研究基因功能、疾病治疗、物种改造等多个领域，具有非常广泛的实践使用价值。云克隆一直致力于 CRISPR/Cas9 技术在细胞系和动物方面的应用，并在技术方面进行了改进，能够更高效、快速的获取基因敲除或基因敲入细胞系和动物模型。

编辑： dxy_8hxjask7    来源：丁香园