流式大牛在线畅谈高阶流式分选技巧——下篇

▊ 样本制备的成功要素

一个成功的分选实验，首先需要我们准备状态良好的样本。为制备良好的单细胞悬液，我们可以参考以下五点建议：添加 DNAse，避免核酸物质引起的团聚；中和 Trypsin，避免细胞过度消化；显微镜观察细胞，确保没有明显可见的团块与死细胞；滤膜过滤，以及上样前保证样本充分混匀。同时，对于高浓度的细胞样本，我们需要稀释样本以避免形成团块，降低冲突事件的发生几率；而对于低浓度的细胞样本，分选速度过低会延长分选时间，导致死细胞增多，提高上样速度后又可能降低分辨率。上述两个条件最终会影响分选结果的回收率，故而我们需要平衡这两者，选择一个合适的样本浓度，这可以根据所分选的细胞种类来调整。

▊ 分选前的仪器设置

样本准备完毕后，我们需要设置正确的仪器条件，以执行分选程序。分选和分析极为相似，但分选要求更为严格。我们必须调整合适的电压条件，以获得最佳的信噪比；同时记录单染样本和 FMO 样本，计算补偿矩阵，以便设置最精确的 gate。在正式分选之前，仪器设置这一步可能会耗费我们半个小时甚至一个小时，此时样本细胞极有可能会重新沉淀聚集，我们需要在分选前对样本再次过滤，以确保严格的单细胞悬液状态。

▊ Tube 分选校正

对于 tube 分选，在分选之前，我们还需确认侧液流的轨迹与落点。在 Sony 的分选仪上，这一步将由软件自动完成，所以我们不用太费精力。而在其他的分选系统上，我们仍需手动调整侧液流的偏转方向。此时，我们需要留意侧液流的偏转角度和收集管的倾斜角度是否一致，当两者不一致时千万不能调整液滴偏转至 tube 中间，因为这极有可能会导致液滴落在 tube 侧壁上；同时我们还需要控制 tube 中收集液体积，确保液滴可以被接收到；某些情况下，一侧的 tube 收集的细胞很多，当 tube 中液体很多时，液滴落下可能会造成一些飞溅，污染到另一侧的 tube，因此及时使用 splatter shield 也很重要。

▊ 孔板分选校正

对于孔板分选，我们同样需要确认液滴的落点处于孔板的孔中间。建议使用角度适配器调整孔板接收角度，以便液滴垂直落入孔中；如果条件允许，也可将非目的细胞加电偏转，使目的细胞垂直进入收集孔板。分选之前，我们可以在板盖上进行液滴打点，约 30-50 个液滴足以分辨打点位置。若使用单细胞分选模式，还可以使用 HRP 显色原理，确认孔板分选精确度（具体操作方法可参考链接 https://www.well.ox.ac.uk/ogc/a-colorimetric-method-to-determine-efficiency-of-facs-sorting/）。

▊ 分选过程中的参数监控

在分选过程中，我们需要对仪器的运行参数定时进行了解，以确保仪器稳定运行，以下 7 个参数可以帮助我们掌握仪器运行状态。首先是液滴断点和液流稳定性，Sony 分选仪可以智能化自行判断，帮我们节省很多精力；其次是收集液体积，我们需要预估分选需要的液滴体积，确保最后的收集液不会溢出；分选速度，一般由液滴频率决定，建议控制在频率的 1/4 以下；上样速度实时变化，可以用于预测液流压力变化和上样管路是否通畅；回收率，了解分选过程中丢弃的细胞数量；散点图细胞群体的位置变化，可以反映液流是否稳定以及上样速度是否过快。

当分选开始后，我们需要预估其持续时间，这一般取决于两个因素：上样速度和目的细胞比例。如 slide 表格所示，在 20000 eps 的上样速度下，不同的细胞比例，其分选耗费的时间也不相同。并且，由于冲突事件发生的可能性，我们需要在原来计算的分选时间的基础上，再额外加上约 50% 的时间。

▊ 分选结果评估

当分选结束后，我们需要安排收集管回测以验证分选结果。结果回测常用的检测参数为纯度，用于评估收集管中混杂了多少非目的细胞。然而我们需要了解的是，纯度并不是最理想的回测指标。有时候回测纯度很低，但仪器实际分选表现很好，低纯度可能是因为分选后细胞状态的变化引起；还有些时候回测纯度很高，但仪器分选表现其实并不理想，因为我们可以通过稀释样本来提高分选纯度，这种情况下仪器性能会首先影响回收率，而非纯度。

我们实验室在分选方面做了大量工作，过去的分选经验告诉我们相比于纯度，回收率其实是更好的回测评价指标。在下面这张 slide 中，我们将使用 Rmax 来描述仪器分选过程中的最大回收率。左侧的样本是两群 beads，分选完成后回测，可以看到 APC gate 共有 1001 events，同时 FITC gate 中出现了 47 events，因此实际的最大回收率 Rmax 为 95.3%。Rmax 可以更好地反映出在非目的细胞群体中，有多少 events 是因为仪器的错误分选而产生的。

▊ 内容总结

最后回顾一下，今天 Peter 和我主要在分选的基本原理和操作细节方面，和大家讨论了分选实验的一些注意事项。首先是选用合适的喷嘴或者芯片，调整最佳的细胞浓度；接着准备良好的细胞样本，设置合适的仪器参数，尤其是要理解 sorting 这一过程可能会对细胞功能产生影响；最后是采用合适的回测指标评价回测结果，例如 Rmax 方法。

◂ Q&A 环节 ▸

Q1：分选样本的最佳浓度条件如何确定？

Lopez 博士：就像 Gardner 博士的 slide 刚才所说的，样本浓度一般取决于两个因素：目的细胞群体占全部细胞的比例和我们需要多少目的细胞。因为某些情况下我们的分选时间是有限的，这需要我们合理控制分选时间。那么我们可以根据以上条件，参考 slide 中的表格，反向计算最初的样本浓度。一般来说反向计算得到的数字，再乘以 1000，即可获得最终的细胞浓度。

Gardner 博士：Peter 的解释非常正确，我想再补充一点，样本浓度也取决于细胞类型。因为分选过程中会有非常多的因素干扰，所以很难来回答哪个浓度是最合适的。一般来说常见的样本浓度会控制在 10E6/ml 范围，对于粘稠细胞或者大尺径细胞，1～5E6/ml 会合适一些，而对于 lymphocytes 来说 10～20E6/ml 的浓度也很常见。上述浓度都有很大的调整范围，这需要我们仔细优化。

Q2：收集管对制造材质（PS/PP）有要求吗？

Gardner 博士：通常我们推荐使用 PP flow tube 来作收集管。

Q3：如何调节样本流速，对 eps 高低有什么要求吗？

Gardner 博士：这是一个好问题！一般我们会使用低流速来保证荧光信号的分辨率，当样本流速提高了，分辨率将会随之下降。所以我们会在分选时尽量使用低的样本流速，但这不代表不能使用高流速。提高样本流速虽然可能导致分辨率下降，但只要我们仍然可以明显区分不同的细胞群体，这也可以接受。但是在提高流速的同时，我们也会丢失更多的目的细胞，降低回收率，所以在提高流速的同时需要确保其不会超过喷嘴震荡频率的 1/4。总的来说，提高流速时我们需要兼顾分辨率、回收率、液流稳定性以及分选速度，在这些条件中间取得平衡。

Lopez 博士：我想补充一点，不同仪器所使用的流速表并不相同，有些仪器使用样本压力表示，有些仪器使用百分比或者上样体积显示，这可能会有些区别，不过最重要的还是要根据实际的样本条件和分选需求来调整流速。

▊ 多功能自动化分选平台 MA900

Soni 博士：我要对 Lopez 博士和 Gardner 博士今天的精彩演讲表示感谢，同时也要为各位听众介绍我们 Sony 最新款的智能型多功能自动化分选平台 MA900，具有基于微流控芯片技术的高度自动化校准功能，可以实现 12 色检测和 4 路分选，以及 96/384 孔板分选等强大功能，让分选实验更加简单。同时，我们也有个人型自动化分选仪 SH800S，同样是基于微流控芯片技术，可以实现高度智能的自动化校准工作，具有 6 色检测（6 channels + 2 scatters），2 路分选和孔板分选功能。若各位想继续了解我们的产品，请访问 www.sonybiotechnology.com 网站查看更多产品信息。

图片来源：索尼生物