各种 EB 替代物凝胶核酸染料的细胞渗透性、安全性及灵敏度的比较

前言

长期以来，由于 EB 的价格便宜、常规应用灵敏度高、使用简单的优势 被用来检测琼脂糖凝胶里的核酸。然而，由于报道显示 EB 在 Ames 测试中 会引发突变，以及对实验员和环境有潜在的危害，一些机构通常要求将 EB 作为危险品处理。正是因为这个原因，人们在寻求用于凝胶电泳安全 的 EB 替代品。Biotium 开发了代替 EB 的安全替代品红色荧光 GelRed™和 绿色荧光 GelGreen™。GelRed™和 GelGreen™两种染料具有膜不通透 性，不会结合活细胞的 DNA，因而具有无毒无突变性。

EB 安全替代物大量上市。我们对比研究了几种凝胶染料替代物，验 证了他们在凝胶染色中的细胞通透性和灵敏度。我们发现许多染料为细胞 透性染料，易于透过活细胞，将核酸和其他细胞结构染色。化学分析显示 这几种产品的染料具有细胞毒性，以及在诱变因素下加强了细胞的破坏。 相反，GelRedTM 和 GelGreenTM 不会轻易透过活细胞。此外，GelRedTM 和 GelGreenTM 相对于其他所谓的安全的核酸凝胶染料，表现出了更高的 染色灵敏度。

材料和方法

凝胶染料、EZ Vision® In-Gel 购买于 VWR、GreenSafe Premium 购买于 Cedarlane、Midori Green Advance 和 RedSafe™ Nucleic Acid Staining、Solution 购买于 BullDog Bio、SafeView™ FireRed 来自 Lucien Orbai 的赠送、其它染料直接购买于厂家（见表 1）

表 1. 各品牌凝胶染料的化学分析                        

化学分析

核酸凝胶染色使用薄层色谱（TLC）分析，使用贝克曼·库尔特　DU-800 紫外分光光度计来测定染料吸收光谱。染料荧光激发光谱在双链　DNA 的存在下，使用日立 F-4500 荧光光度计来检测。质量分析（LC-MS）在安捷伦 6130 四级杆系统中进行，HPLC C18 反相色谱在安捷伦 1100 分析系统上进行，来自 Biotium 的 DAPI（批号 40011）、碘化丙啶（批号 40016）、吖啶橙（批号 40039）用于对照染料。源于西格玛的吖啶橙（批号 235474）也用于对照。

细胞染色

希拉细胞放在 2x104 个细胞孔的板上，用 96 孔板的玻璃盖 盖好，电镀后的第二天，细胞在培养基中培养用表 2 中指示的凝胶染色 5 分钟或者在 37℃ 下 30 分钟，浓度如下表所示。用新鲜的没有染色剂的培养基更换旧的培养基，然后用 Zeiss LSM 700 的共聚焦显微镜观察细胞颜色，那些细胞膜没有渗透进染料的。对于细胞通透性染料，远红外荧光 CF™640R 麦胚凝集素 (Biotium) 在 37℃ 下孵育 30 分钟，使细胞表面标记好能够是细胞成像。

凝胶电泳

凝胶染色可通过生产厂家预制或者电泳后染色。GelRed™, GelGreen™,SYBR® Safe, Midori Green Advance, and EZ-Vision® In-Gel 这些厂家是电泳后染色。RedSafe™, SafeView™ Classic, and SafeView™ FireRed 是使用预制凝胶。琼脂糖凝胶（1%TBE）配制到不含染料的电泳染色中，预制凝胶染色之前，将染料加进融化的琼脂糖里。对于 SafeView™ FireRed 来说，各产品说明书中缓冲液也包含了染料。Biotium 的 1kb 的 DNA200-12.5ng 的系列被加载到每个凝胶中，在 1 倍的 TBE 缓冲液中 90 分钟运行了 100v。凝胶在室温摇动下在含有染料的 50 ml 水中染色 30 分钟。预制凝胶在电泳后直接成像。凝胶在配有紫外的 UVP GelDoc-It®或者 SYBR® Green 滤过器成像。另外，凝胶也可以用蓝色 LED 光源（465-475nm）成像。

核酸凝胶染料对比

图 1. 吖啶橙和基于 SYBR 核酸凝胶染料迅速渗入细胞, 使细 胞核、细胞质和其他细胞器染色。在表 2 的指示浓度 下，Hela 细胞在稀释的核酸凝胶染色培养基中 37℃ 孵育 5 分钟。

A Redsafe. B Safeview classic. C Midori greenadvance；插图显示了单层细胞顶端零星死亡细胞的蓝色荧光染色的不同视野；D GreenSafe Premium; 插图显示了单层细胞顶端零星死亡细胞的蓝色荧光染色的不同视野；E SYBR Safe.  F Nancy-520，插图显示了细胞在 37℃ 下孵育 30 分钟。绿色荧光在 10% 的激发能量下的 488nm 激光和 490nm 长通滤光片下拍摄。绿色荧光在激发光488nm，功率 10%，490nm 长通道滤波器成像，Midori Green Advance, GreenSafe Premium,Nancy-520 的主增益设置为 500。RedSafe, SafeViewClassic, and SYBR Safe 的主增益设置为 450。蓝色荧光在激发光 405nm，功率 10%，490nm 短通道滤波器，主增益设置为 650 成像。比例尺：20 um

结论

化学分析和核酸染色

研究发现含有吖啶橙，一种细胞膜透性染料，常用于活细胞染色。吖啶橙 在绿色荧光下染色 DNA，在红色荧光下染色 RNA 和酸性细胞器。Midori Green Advance 和 GreenSafe Premium 也含有低含量的苯基吲哚，一种常用 于蓝色荧光的 DNA 复染剂。EZ-Vision® In-Gel 也发现含有苯基吲哚。低浓度 时，DAPI 细胞膜通透性较弱，但是高浓度时可用于染色活细胞。SafeView™ FireRed 含有碘化丙啶 PI，PI 是可结合 DNA 和 RNA 的红色荧光通透性染料，通 常作为死细胞的特异性染料。SYBR®Safe（1）和 Nancy-552（2）的结构 先前已被报道过。

活细胞染色

基于吖啶橙的染料 Midori Green Advance, GreenSafe Premium, SafeView™ Classic, and RedSafe™迅速透过活细胞的生物膜。这些染料在 5 分钟的孵育后，细胞核、核仁, 胞浆和胞内多孔结构都显示了强烈的染色（图 1）。红绿荧光都可发现（未展示）。这些结果都与这些凝胶染料的生化分析 保持了一致性。吖啶橙在绿色荧光下染色 DNA，在红色荧光下染色 RNA 和酸 性细胞器。Midori Green Advance 和 GreenSafe Premium 也显示了单层细 胞顶端零星死亡细胞的蓝色荧光染色的不同视野（插图 1C 和 1D），与低浓度 的 DAPI 情况下保持一致，在染色渗透等离子体膜的死细胞时有较弱的渗透率和优先率。

Nancy-520 和 SYBR® Safe 显示 5 分钟后线粒体定位模式下的明亮染色, 以 及一些细胞质和核染色 (图 1)。30 分钟后, Nancy-520 显示强大的核和胞质染 色 (插图 1 F), 类似于我们以前观察 SYBR® Safe（未显示)SafeView™ FireRed, EZ-Vision® In-Gel, GelRed™和 GelGreen™ 没有 显示出 5 分钟孵育后对活细胞的染色力，但只染了单层细胞顶端零星死亡细胞（未展示）。37℃ 孵育 30 分钟后，SafeView™ FireRed, EZ-Vision® In-Gel, or GelRed™ 没有发现染色活性细胞。这些结果与这些凝胶染料的生化分析结 果一致。30 分钟孵育后，发现 GelGreen™ 在更高增益设置时线粒体染色较 弱，但没有发现核酸染色。为了膜通透性染料的染色细胞更好的成像，远红外 荧光 CF™ 640R 麦胚凝集素 (WGA) 与这些染料混匀 30 分钟。没有 WGA 情况下 发现了这些核酸凝胶染料有相同的染色结果 (没有显示)。表 2 总结了细胞染色 结果。

图 2.GelRed™, GelGreen™, and EZ-Vision® In- Gel，SafeView™ FireRed 在 37℃ 下孵育 30 分钟不会使细胞 核染色。Hela 细胞使用表 2 中的核酸染料浓度在培养皿中孵 育，插图显示 CF640R WGA 染料（品红）在细胞可见框架上 显示了同样的视野。高亮染色只在单层细胞顶端零星的死亡细 胞中发现。A. GelRed（红色荧光）在激发光 555nm，功率10%，640 的发射波长通过短波滤波器调节为 600nm 处成 像。B. GelGreen（绿色荧光）在激发光 488nm，功率10%，640 的发射波长通过短波滤波器调节为 600nm 处成 像。C. EZ-Vision® In-Gel（蓝绿色荧光）在激发光 405nm，功率 10%，640nm 的发射波长通过短波滤波器调节 为 550nm 处成像。D. SafeView™ FireRed 在激发光 555nm，功率 10%，640nm 的发射波长通过短波滤波器调节 为 600nm 处成像。比例尺：20um。

凝胶电泳在预制凝胶中，依赖于片段的长度，包含 0.625 到 1.25ng 的双链 DNA 条 带在 GelRed™ (图. 2B) 和 GelGreen™ (图. 2C) 可被检测。对于 500bp 的 条带，1.25ng 很容易被检测到而 0.625ng 很少被发现。但是对比 GelRed™，SafeView™ FireRed 在双荧光下能够在 500bp 的条带检测到 1.25ng (图. 2D)，RedSafe 相对于其他染料，其背景较高，在 500bp 的 条带上只能检测到 2.5ng (图. 2E)。在电泳染色后的凝胶中，GelGreen™能够在 500bp 的条带检测到 1.25ng。然而 GelGreen™推荐的染色后的时间为 30 分钟，5 分钟孵育后得到了非常相近的结果 (图. 2F)。与 30 分钟相比 (图. 2 G)，Nancy-520(Fig. 2L) 跟 GelGreen™一样表现出来类似的灵敏度，但是双信号。SafeView™ Classic (图.2 H), GreenSafe Premium (图.2J), Midori Green Advance (图.2K), 和 SYBR® Safe (图.2M) 能够在 500bp 的条带 检测到 2.5ng。EZ-Vision® In-Gel (图. 2I) 在 500bp 的片段上只能检测到 2.5 ng。SafeView™ Classic (图.2 H), GreenSafe Premium (图.2J), and Midori Green Advance (图. 2K) 与其他凝胶染料相比表现出了较高的背 景。表 2 中总结了电泳的结果。

绿色荧光凝胶染料像 GelGreen™有一个特点，就是他们的吸收大约 500nm 左右的波长 (图.4A)，他们在可见蓝色 LED 光源下可激发。使用可见光源避免了紫外的辐射。据报道凝胶纯化的 DNA 的克隆率也在可见光源下得到了提高，大概是由于在凝胶剪切的过程中 DNA 避免了紫外的损伤（3）。吸收光谱显示 EZ-Vision®的吸收峰接近 350nm，类似 DAPI(图.4A)。所以，不同于 GelGreen™(图.4B)，EZ-Vision®与蓝色光源 (图.4C) 不可协同使用。

讨论

市场上基于 EB 在一些试验如 Ames 测试中表现出来低诱变性，因而认为核 酸染料比 EB 更加安全，许多厂商在他们的商标上都冠以安全的字号。我们 发现这几种染料都能迅速透过细胞并且跟细胞核反应，增加了活细胞或者 DNA 损伤的可能性。GelRed™和 GelGreen™已由各独立实验室证实其无 法进入活细胞, 因此无毒。(4、5)

生化分析显示很多染料含有吖啶橙。吖啶橙具有高细胞渗透性，已被证实 具有潜在的 DNA 威胁（6），由于它的细胞毒作用而被用于抗癌药物。也 有报道显示，基于吖啶橙的 RedSafe™核酸染色试剂在 V79 细胞中具有比 EB 更高的细胞渗透性，V79 细胞长用于生化安全性分析（8）。除此之 外，含有吖啶橙的染料以被证实其灵敏度低，背景高。

SYBR® Safe 是作为一个较早的溴化乙锭安全替代品。然而, 据报道显示在 艾姆斯测试中代谢活化后表现出了诱变性 (9)。然而 SYBR® Safe 却报道在 叙利亚仓鼠胚胎细胞和 L5178YTK + / -小鼠淋巴瘤细胞中没有诱变性 (10), 由于其过度的细胞毒性，它的测试浓度远低于其工作浓度 1 x 0.66 ug / ml(11) (9)。这些结果符合 SYBR® Safe 快速穿透细胞膜和染色活细胞的细 胞核这一事实。 Nancy-520, 一种荧光染料衍生物, 也容易穿透活细胞与 DNA 相互作用, 这表明它有相似的潜在细胞毒性。此外, 这些染料还显示在 灵敏度方面相比 GelRed™ 或 GelGreen™并没有优势。

SafeView™ FireRed 被发现含有碘化丙啶, 通常用于死细胞染色。与此一 致的是, SafeView™ FireRed 不能染色活细胞。然而, 据报道, 碘化丙啶长 期暴露 (1 天) 会对 J774 细胞产生细胞渗透和细胞毒性 (5)。在相同的研究 中,GelRed™和 GelGreen™长达三天的孵育是无细胞透性和无毒 的 (5)。EZ-Vision® In-Gel 也被发现其细胞不透性, 与它所包含的 DAPI 一 致。然而,EZ-Vision®灵敏度很低，不能做到像 GelGreen™一样兼容可 见蓝光凝胶成像仪。

我们建议将所有实验室试剂作为潜在危险品处理, 使用通用的安全措施如 手套、实验服, 眼睛保护。减少接触有毒或诱变物质的风险，也可以通过 避免化学物质直接穿透细胞膜、在活细胞中与 DNA 相互作用, 即使它们贴 上「安全」的标签。

GelRed™和 GelGreen™是无毒, 无诱变的染料，其工作浓度不易穿透活细 胞。他们也在 CA 规定下通过 22 项检测，被归类为无害废物处置（12）。 GelRed™和 GelGreen™相比其他 EB 替代品表现了更高的灵敏度。

参考文献

1. Evenson, W.E. et al. 1 H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry 2012, 77 (23), 10967-10971.

2. Rueck, A. et al. Nucleic acid fluorescent stains. U.S. Patent Application No. 12/502,439, Publication No. US20100041045 A1, filed July 14, 2009, published February 18, 2010.

3. Gründemann, D and Schömig, E. Protection of DNA During Preparative Agarose GelElectrophoresis Against Damage Induced by Ultraviolet Light. BioTechniques 1996, 21 (5),898.

4. Haines, AM. et al. Properties of nucleic acid staining dyes used in gel electrophoresis.Electrophoresis 2015, 36 (6), 941-944.

5. Chiaraviglio, L and Kirby, JE. Evaluation of Impermeant, DNA-Binding Dye Fluorescence as a Real-Time Readout of Eukaryotic Cell Toxicity in a High Throughput Screening Format. Assay and Drug Development Technologies 2014, 12 (4), 219-228.

6. Ohta, T. et al. Ethidium bromide and SYBR Green I enhance the genotoxicity of UV-irradiation and chemical mutagens in E. coli. Mutat Res 2001, 492 (1-2), 91-7.

7. Kusuzaki, K. et al. Review. Acridine orange could be an innovative anticancer agent under photon energy. In Vivo 2007, 21 (2), 205-14.

8. Schmidt, F. et al. DNA staining in agarose gels with Zn(2)+-cyclen-pyrene. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2010, 29 (10), 748-59.

9. Report: SYBR Safe DNA Gel Stain, Assessment of Mutagenicity and Environmental Toxicity. http://probes.invitrogencom/media/publications/494.pdf

10. Beaudet, M.P. et al. Safety testing of SYBR Safe, a non-hazardous alternative to ethidium bromide. http://probes.invitrogen.com/media/publications/519.pdf

11. The working concentration of SYBR Safe was calculated using the absorbance of the 1X solu- tion, the extinction coefficient for SYBR dyes (70,000) and the molecular weight of SYBR Safe reported in reference 1 (MW 505).

12. Safety Report of GelRed and GelGreen. https://biotium.com/wp-content/uploads/2013/07/ GR-GG-Safety.pdf

GelRed 和 GelGreen 已经被全球客户广泛使用和认可, 拥有美国和国际专 利保护。EZ-Vision 注册商标为 AMRESCO; SafeView 是应用生物材料公 司的商标; RedSafe 是 iNtRON Biotechnology 的商标. SYBR 是 Thermo Fisher Scientific 的注册商标。

编辑： qimx    来源：丁香园