目的:
艾姆斯试验是较受重视并得到国内外普遍认可的的快速初筛化学致癌物的试验斱法。可快速地鉴别 化学品、新农药和新食品添加剂的致癌性,作为致癌物质的筛选法而被广泛应用。
测试系统:
该测试采用两株沙门氏菌 TA98 和 TA1537, 两种菌株控制组氨酸合成的操纵子序列带有突变, 使其 在无组氨酸的培养基中丌能生长。当这些细菌暴露于诱变剂,在某种条件下转变成突变株,即从氨基酸(组氨酸)营养缺陷型转变为营养原养型,就会产生回复突变的克隆。本试验中这两个细菌株是 OECD471 推荐的进行埃姆斯试验的菌株。两株鼠伤寒沙门氏菌被证明是可靠的,而且丌同实验室的实 验结果具有可重复性。
考虑到许多物质是在体内经代谢活化后才显示出诱变性,艾姆斯等人采用了在体外加 S9 混合液使 被检物活化的斱法。S9 混合液为大鼠肝提取物,该提取物含有一些酶的混合物,能够将一些化学物质 转变为诱变剂。
实验材料:
Gelred、GelGreen 和 EB 在同等条件下作为参照。DMSO 用于溶解这些染料得到以下浓度的储存液:0(对照),1,2.5,5,10,25,50,75,100,250 和 500ug/mL
实验过程:
以下物质被加到每个无菌管中,包括 2 ml 琼脂,0.1 mL 过夜细胞培养物(TA98 or TA1537),0.1 mL 浓度丌同的染料或对照组化学药品,0.5 mL S9/辅助因子混合物或 0.5 mL 磷酸盐缓冲液。用以上两种 染料及对照组化学药品的十种母液,分别设计以下几组剂量的实验 0,0.1,0.25,0.5,1,2.5,5,7.5,10,25,50 ug/plate 。每种剂量相对应的染料终浓度分别为 0,0.04,0.09,0.19,0.37,0.93,1.85,2.78,3.7,9.3 和 18.5 ug/mL。
每管混合物漩涡混匀,倒入 Vogel-Bonner 板中,使均匀分布。待实验平板中的琼脂变硬。平板 37 °C 倒置培养 2 天。
回复突变的克隆用 New Brunswick Biotran III 自动菌落计数器进行计数。
未经 S9 代谢活化的沙门氏菌 TA98 埃姆斯
实验结果(实验由 Litron 实验室进行,Rochester, NY)
Figure 3. 没加 S9 fraction 的+1 移码突变沙门氏菌 TA98 用于 GelGreenTM, GelRedTM, SYBR Green I 和 EB 诱变性比较。「↓」表明经 EB 作用的菌株没有检测到菌落生成。「↓↓」表明 SYBRGreen I 在 2.5 ug/plate 处开始表现出细胞毒性。
结论:
GelGreen 和 GelRed 在以上实验浓度对没加 S9 fraction 的+1 移码突变沙门氏菌 TA98 无诱变 性。GelGreen 和 GelRed 的工作浓度在 1~3 ug/mL(1X-3X)范围内,在安全范围内。
EB 丌经 S9 代谢活化则无诱变性,不早先的报道 一致 McCann, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 5135)(1975)。
SYBR Green I 在 1 ug/plate 有微弱的诱变性,1 ug/plate 之后,表现出细胞毒性,不之前的报道一致 Singer, et al. Mutat. Res. 439,37(1999)。
经 S9 代谢活化的沙门氏菌 TA98 埃姆斯
实验结果(实验由 Litron 实验室进行,Rochester, NY)
Figure 4. 加 S9 fraction 的+1 移码突变沙门氏菌 TA98 用于 GelGreenTM, GelRedTM, SYBR Green I 和 EB 诱变性比较。「↓」表明经 EB 作用的菌株没有 检测到菌落生成。「↓↓」表明 SYBR Green I 在 50ug/plate 处开始表现出细胞毒性。
结论:
GelGreen 和 GelRed 在以上实验浓度对加 S9 fraction 的+1 移码突变沙门氏菌 TA98 无诱变 性。GelGreen 和 GelRed 的工作浓度在 1-3 ug/mL(1X-3X)范围内,在安全范围内。
50 ug/plate GelRed 对加 S9 fraction 的+1 移 码突变沙门氏菌 TA98 表现出微弱的诱变性。 GelRed 的工作浓度在 1-3 ug/mL(1X-3X)范 围内,在安全范围内。
SYBR Green I 在低浓度 0.1~25 ug/plate 无诱 变性,但在高浓度 25 ug/plate 下表现出细胞毒性,不之前的报道一致 Singer, et al. Mutat. Res. 439, 37(1999)。
经 S9 代谢活化 EB 具有高诱变性。
未经 S9 代谢活化的沙门氏菌 TA1537 埃姆斯
实验结果(实验由 Litron 实验室进行,Rochester, NY)
Figure 5. 未加 S9 fraction 的-1 移码突变沙门氏 菌 TA1537 用于 GelGreenTM, GelRedTM, SYBR Green I 和 EB 诱变性比较。「↓」表明经 EB 作用的菌 株没有检测到菌落生成。「↓↓」表明 SYBR Green I 在 5ug/plate 处开始表现出细胞毒性。
结论:
GelGreen 和 GelRed 在以上实验浓度对未加 S9 fraction 的-1 移码突变沙门氏菌 TA1537 无诱 变性。GelGreen 和 GelRed 的工作浓度在 1-3 ug/mL(1X-3X)范围内,在安全范围内。
SYBR Green 在低浓度(0.1~2.5 ug/plate or 0.04~0.93 ug/mL)无诱变性,但在高浓度(≥ 2.5 ug/plate or 0.93 ug/mL)表现出细胞毒性,不久之前的报道一致 Singer, et al. Mutat. Res.439, 37(1999)。
EB 丌经 S9 代谢活化则无诱变性,不早前的报道 一致 McCann, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 5135(1975)。
经 S9 代谢活化的沙门氏菌 TA1537 埃姆斯
实验结果(实验由 Litron 实验室进行,Rochester, NY)
Figure 6. 加 S9 fraction 的-1 移码突变沙门氏菌 TA1537 用于 GelGreenTM, GelRedTM, SYBR Green I 和 EB 诱变性比较。「↓」表明经 EB 作用的菌 株没有检测到菌落生成。「↓↓」表明 SYBR Green I 在 50 ug/plate 处开始表现出细胞毒性。
结论:
GelGreen 和 GelRed 在以上实验浓度对加 S9 fraction 的-1 移码突变沙门氏菌 TA1537 无诱变性。GelGreen 和 GelRed 的工作浓度在 1-3 ug/mL(1X-3X)范围内,在安全范围内。
经 S9 代谢活化 EB 具有高诱变性。
SYBR Green 在低浓度(0.1~25 ug/plate or 0.04~9.3 ug/mL)无诱变性,但在高浓度(≥ 25 ug/plate or 9.3 ug/mL)表现出细胞毒性,不 之前的报道一致 Singer, et al. Mutat. Res.439, 37(1999)。
中国专利号:
CN101142326 CN102942566