ChIP 问题&解答
1、ChIP是什么?
答:染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。
2、ChIP有哪些应用?
答:近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。
3、ChIP技术的原理?
答:生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。
4、做ChIP试验,必须做甲醛固定么?
答:不一定,视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP,而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。
5、为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小(大约3个核小体 ~400-500bp)?
答:为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。
6、为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子?为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应?
答:鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验,所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。
7、引物最佳设计是什么样的?
答:引物长度应为24个核苷酸,应含有50%GC碱基对,Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。
8、您推荐下如何从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物,用来做re-ChIP试验?
答:在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液,用它洗脱复合物。对于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液,及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温,蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。
9、蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?
答: 蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。
10、在做ChIP之前,有办法纯化细胞核么?
答: 在细胞与甲醛交联后,细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器(dounce homogenization)制备(至少10倍体积)。
溶胀缓冲液:
25M Hepes, pH 7.8
1.5mM MgCl2
10mM KCl
0.1% NP-40
1mM DTT
0.5mM PMSF
蛋白酶抑制剂混合剂
然后按照protocol在SDS裂解液中裂解
11、ChIP超声波的最佳条件?
答: (1) 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。
(2)脉冲应在~10秒(与体积一致)。
(3)样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。
(4)避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。
(5)若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。
(6)在按“开始”键之前将探头置于液体中。
12、客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?
答:是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:
13、ChIP超声波的最佳条件?
答: (1) 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。
(2)脉冲应在~10秒(与体积一致)。
(3)样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。
(4)避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。
(5)若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。
(6) 在按“开始”键之前将探头置于液体中。
14、客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?
答:是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。
15、什么是input DNA? Output DNA?
从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.
其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.
16、为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?
抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。
17、什么是reChIP技术?
ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。
18、非特异性抗体对照背景高
A1:非特异性结合Protein A 或G beads
A2:ChIP缓冲液污染了
A3:有些Protein A or G beads 产生高背景
19、PCR信号弱
A1:染色质的片段太小了
A2:如做的是X-ChIP,有可能是细胞被交联太久
A3:染色质用量不足
A4:免疫沉淀用抗体量不足
A5:特异性的抗体结合被清除了
A6:细胞没有被完全裂解
A7:目标区域没有抗体被富集
A8:不适合使用N-ChIP方法
A9:所选的单克隆抗体可能不适合X-ChIP方法
A10:使用了错误的抗体亲和beads
20、PCR扩增出现问题
A1:所有标本包括模板对照PCR结果信号均过高
A2:标本PCR结果阴性
21、背景高、电泳结果难以分辨大小
A1:DNA片段太大
非特异性抗体对照背景高 非特异性结合Protein A 或G beads 将标本和beads混合孵育1hr后去除,然后再加入抗体进行反应(包括预纯化标本步骤)
ChIP缓冲液污染了 重新配制新的缓冲液
有些Protein A or G beads 产生高背景 有些Protein A/G beads 产生高背景.尽量使用在非特异性对照中背景很低的Protein A/G beads;
背景高、电泳结果难以分辨大小 DNA片段太大 对不同类型的细胞,DNA 片段化过程要进行优化。破碎后的DNA片段不应该大于1.5 kbp. 如果使用酶消化染色质的话,应该可以看到单个核小体的存在 (175 bp);
信号弱 染色质的片段太小了 染色质超生破碎的大小不能小于500bp。太小的片段会使的核小体被误认为核小体间的DNA而被消化掉。如果做N-ChIP,酶切反应足够来片段化染色质了;
如做的是X-ChIP,有可能是细胞被交联太久 用甲醛交联10-15分钟然后用PBS洗涤。细胞可能需要用甘氨酸处理以去除多余的甲醛.过度的交联会封闭抗原结合表位从而降低抗体的结合;
染色质用量不足 推荐每次实验染色质的用量是25 ug;
免疫沉淀用抗体量不足 推荐使用3-5 ug抗体进行初次实验,如果没有信号则可以增加到10ug的用量;
特异性的抗体结合被清除了 洗液中的NaCl 浓度不能高于500 mM ,因为这个浓度过强,有可能会消除特异性的抗体结合;
细胞没有被完全裂解 推荐使用RIPA buffer裂解细胞(参考X-ChIP方法);
目标区域没有抗体被富集 抗体结合表位不存在感兴趣的DNA区域。使用阳性对照抗体,以保证整个操作过程的正确性,如H3K4me3/H3K9me3抗体对应active/inactive promoters;
不适合使用N-ChIP方法 当待测蛋白和DNA的结合比较弱或者离DNA比较远时,最好使用X-ChIP。因为交联可以避免在操作过程中蛋白质从DNA上脱落下来。而Histones通常具有很强的DNA亲和力,因此分析时常用N-ChIP;
所选的单克隆抗体可能不适合X-ChIP方法 在交联过程中,可能抗体的结合表位被封闭了。推荐使用多克隆抗体,因为具有多个抗原结合表位从而增加了IP靶蛋白的成功率;
使用了错误的抗体亲和beads Protein A和G结合不同的Ig. 选择使用能有效结合抗体的Protein beads。推荐使用protein A和G的葡聚糖混合物从而增加沉淀抗体的成功率;
PCR扩增出现问题 所有标本包括模板对照PCR结果信号均过高 real-time PCR溶液污染了,换用新鲜配制的新溶液重新进行PCR;
标本PCR结果阴性 使用standard/input DNA确认引物是否正确。
22、ChIP 8--让ChIP成功开展的建议
染色质免疫沉淀(ChIP)是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。虽然ChIP技术的原理不复杂,但是对技术的要求高,实验步骤的设计摸索耗时耗力,实验耗费时间长。也许您从未开展过ChIP,也许您的ChIP结果有待改善,那么,听一听专家的建议吧。
(1)是否需要交联?
交联的目的是将感兴趣的抗原固定在其染色质结合位点。若没有交联的步骤,就意味着只有与染色质结合非常紧密的蛋白质能被免疫沉淀,譬如组蛋白。若您的研究对象是组蛋白,那可能不需要交联,而其他蛋白,如转录因子和DNA结合复合物中包含的蛋白,可能还需要交联。如果使用交联,则ChIP反应被称为X-ChIP,则天然的ChIP反应被称为N-ChIP。然而,确实有一些抗原不适合用X-ChIP这种方式,因为在交联过程中它们的表型会发生变化,或出现包涵体。
(2)片段化 & 酶切消化
染色质必须片段化,才能让相互反应接触到抗体。无论您采用哪种方法,都必须确保一定的片段化时间进程。对于X-ChIP,超声波处理是必需的,因为甲醛交联限制了酶切的效果。超声波处理的条件要自己来优化,不过说明书上通常都会给出一个参考条件。超声波产生了随机的DNA片段(平均500-700 bp)。在开展N-ChIP时,微球菌核酸酶的消化可产生~175 bp的单体。酶切消化的优势在于消化的重复性好,易控制反应。
(3)抗体用对没有?
如果可以的话,使用经过充分验证、ChIP级别的抗体。当然,这种抗体并不多。如果没有,也可以选择普通的免疫沉淀抗体,或能够识别天然表位的抗体。一般来说,多克隆抗体是个更好的选择,因为单克隆抗体只识别单个表位,而这个表位有可能在交联过程中被掩盖。而另一方面,单克隆抗体却往往有着更好的批间一致性。抗体的量和使用的条件都应根据使用经验来确定。一般情况下可以从每50ug DNA使用2-5ug抗体作为起始条件开始摸索。
(4)对照也很重要
作为ChIP技术的阳性对照,H3K4me3和H3K9me3分别适用于激活和失活的基因。作为阴性对照,可选择一个识别非染色质表位的抗体,如GFP抗体。但要记住,这些抗体本身不是阳性和阴性对照,因为这取决于您正在研究的位点。如果在您研究的位点无H3K4me3,即使是最好的ChIP级别的H3K4me3抗体也不能让任何东西免疫沉淀,那么这就不是一个理想的阳性对照。如果您的实验室刚刚开始用ChIP,最好考虑购买试剂盒。
23、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75%-80%比较好。
24、抗体
抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体,另外如果经济条件许可的话,尽量买大厂的抗体。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域),选择多抗比较稳妥一些。
25、关于交联与超声破碎
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲,按照我的经验,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器,那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般,理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。
26、操作
希望尽可能的保持低温(4度)。沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,我还是希望你能够连续把它做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
27、解交联
虽然说明书上说4小时已经足够,但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
28、DNA片段的回收
需要注意的是:样品中SDS样品较高,普通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在最终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。
29、固定与超声
虽然固定和超声只是样本的准备,但这步是实验成功的关键,也是出来漂亮结果的关键。不同的仪器,超声的条件差别很大,所以不能单纯的按照说明书来做,要根据自己的仪器,摸索适当的条件,另外,超声时样本的体积不宜过大,体积过大超声容易不均匀,效果不理想,400ul左右就完全可以(这个跟超声仪探头的直径也有关系)