免疫组库测序产品FAQ
一、基础知识
Q1: 什么是免疫组库？
A1: 免疫组库是以T/B淋巴细胞为研究目标，多重PCR（或5’RACE）结合高通量测序为技术手段，全面评估免疫系统的多样性，识别并量化体内免疫应答增殖克隆，从而对免疫学基础，疾病机理和药物开发等进行研究。
Q2: 免疫系统拥有哪些类型的蛋白？
A2: 免疫系统拥有6个主要类型的蛋白，分为免疫球蛋白的轻链和重链、TCRα，TCRβ，TCRγ和TCRδ，每一种免疫蛋白拥有彼此间细微差异的数量巨大的亚型。对于一个生物体而言，免疫系统产生的免疫蛋白可以识别暴露在生存环境中的特异性抗原，帮助生物体对抗病原侵袭或调节机体在癌症或自免疾病情况下的平衡，越多的亚型越能确保病原体在免疫系统面前无处遁形。
Q3: 华大免疫组库测序主要针对哪几种类型的免疫蛋白进行研究？
A3: 华大能针对TCRα、TCRβ、免疫球蛋白的轻链（IGL）和重链（IGH）进行研究。
Q4:华大为什么要推出免疫组库测序？
A4.免疫组库的研究针对T 细胞受体，抗体，虽然相较基因组是非常渺小的一部分，但这些却是生物体与外界环境互作的核心。TCR与抗体的CDR3序列信息能够整体反应一个生物体免疫组库状态。但传统的技术的研究方法面对免疫组库强大的多样性则显得有心无力，新一代高通量测序技术的出现带来了技术上的革新，单次测定几十万到几百万条序列的通量为免疫组库全面、系统的研究提供了高效的技术平台，对于疾病发生、发展的分子机制研究有着重要的意义。
Q5: 华大采用什么方法得到目的片段（CDR区）？
A5: 对客户送来的DNA或RNA采用多重PCR或5’RACE的扩增方法得到CDR3或CDR区域，其中多重PCR引物设计扩增CDR3区域，可适用于DNA或RNA样品，而5’RACE的方法可扩增整个CDR区，适用于C区域已知物种的RNA样品。
Q6:免疫组库测序的基本研究方法？
A6: 免疫组库测序的基本研究思路如下：
二、市场反馈FAQ
Q1:免疫组库测序与其他技术的不同之处是什么？
A1:免疫组库技术针对CDR区域序列进行扩增，利用高通量平台获得高深度序列，产生可以反映某一特定时期其复杂的T-细胞多样性的序列。
Q2: 免疫组库测序主要适用于哪些研究？
A2:免疫组库拥有广阔的应用领域，通过高通量测序平台的巨大的通量测量免疫组库多样性的检测方法，可提供个体某一特定时期完整的多样性信息，探究抗体与TCR在适应性免疫过程中的变化。使得免疫组库在疫苗和医药的发展、生物标志物的发现、最小残余疾病检测、自身免疫性疾病的研究以及移植后监测等都具有应用价值。
Q3:华大能提供什么类型的服务？
A3: 我们可以提供TCRα、TCRβ、免疫球蛋白的轻链（IGL）和重链（IGH）的扩增服务；
PE100，PE150reads读长的高通量测序服务；
标准化及个性化的信息分析服务。
三、样品要求及运输
Q1: 华大免疫组库测序能接收的什么样品？
A1.我们推荐客户自己提取PBMC、DNA或RNA样品送到华大，对于提取有困难的客户也能够接收全血和组织样本代为提取。
Q2: 华大免疫组库测序适用于什么物种？
A2. 主要针对人的样本，其它物种需要进行个性化评估，如果C区序列已知并完整可进行研究。
Q3: 华大免疫组库测序对送来的总RNA样本要求如何？
A3: 免疫组库测序对总RNA样本要求如下：
Q4: 华大免疫组库测序对DNA样本要求如何？
A4: 免疫组库测序对DNA样本要求如下：
Q5: 如果客户送PBMC样本，送样要求如何，该如何送样？
A5: 如果客户送PBMC样本，至少需要106个细胞，注意不要用肝素抗凝剂，其他按照常规操作即可。样本运输参考最新送样建议。
四、建库测序FAQ
Q1: 免疫组库测序的建库方案是什么？
A1:对客户送来的DNA或RNA采用多重PCR或5’RACE的扩增方法得到CDR3或CDR区域，然后进行常规的加接头建库过程。
Q2: 多重PCR的原理？
A2: 在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
Q3:5'RACE原理？
A3:5'RACE即5’末端的快速扩增法，用特异性引物进行逆转录后，在cDNA的一链5'末端引入接头，进行二次无bias的PCR扩增，并通过亲和素磁珠富集，获得含CDR区域的目标序列。
Q4: 多重PCR扩增与5'RACE扩增有什么不同？
A4:5’RACE主要是通过逆转录扩增，而多重PCR是在同一反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段。两种方法的引物设计如下图所示：
两种技术的详细比较见下表：
|
| 多重PCR | 5’RACE |
| 原理 | 与普通PCR相同 | 从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5’末端 |
| 扩增区域 | CDR3 | CDR |
| 适用样品类型 | DNA、RNA | RNA（需C区已知） |
| 优点 | 操作相对简单，不用打断，数据完整 | 扩增产物一致，可最大程度避免PCR扩增偏向性 |
| 缺点 | PCR扩增偏向性 | 操作繁琐，实验打断会丢失部分序列，重复性不如多重PCR |
Q5: 华大科技服务对于免疫组库测序文库制备有哪些现有经验？
A5: 已有上百例样本成功建库经验，建库成功率较高，但经验集中在human样本，其他物种经验较少，目前只有人的样品为标准化产品，其他物种均需由相关业务线进行评估。
Q6: 免疫组库测序各测序平台的适用范围？
A6:hiseq2000：平台成熟，质量值高；读长较短，只能测CDR3。
hiseq2500：测序速度快，可测PE100和PE150，PE150读长比PE100长；快速模式有项目周期优势。
Miseq：PE250有读长优势，可以测CDR1、CDR2、CDR3，有利于抗体改造等应用。
Q7: 免疫组库的测序深度？能得到多少序列？
A7: 测序深度一般根据序列的多样性来确定，比如一次PCR可以获得106种序列，而每一种序列平均表达在10左右，换算过来大概是20M reads，以Hiseq2000 PE100测序计算数据量则是2G clean data。
Q8: 能向客户提供文库制备的实验记录资料吗？
A8: 关于文库制备方面的资料属于核酸平台保密资料，抱歉我们不能为您提供。
五、信息分析FAQ
Q1:免疫组库测序主要提供哪些方面的信息分析服务？
A1: 主要的分析内容有：基本数据统计、Contig长度分布统计、CDR3长度分布统计、序列结构分析、V-J匹配分布图和克隆表达谱分析。
Q2: 序列结构分析主要包括哪些内容，有什么意义？
A2:在比对分析鉴定出测序数据对应的基因片段和基因家族后，即可分析测序数据的序列结构特征。包括VDJ基因链接时出现的碱基插入和缺失分析及各个位点的碱基成分分析，通过查找基因家族中的碱基插入缺失可以获取相应氨基酸的变化情况，以研究其功能的特异性；同时，统计基因插入缺失数量信息研究受体多样性产生和进化信息。由于华大的流程中使用了重比对的方法，结果的准确性较高，因此，碱基插入缺失的检出率也更加准确。
Q3: 克隆表达分析方法？
A3: 比对分析鉴定出序列的VDJ基因后，就可以统计重组后基因的表达了，将序列一致的序列用哈希累加在一起，即可获得每一种reads的表达数，该表达数从统计学上可以代表一种细胞的相对数量。同时，根据V-J配对的情况，可以统计每一类V-J配对的序列的表达情况，并通过3D图和热图，直观的看到表达多样性的变化情况。
六、售后问题汇总
Q1: 文献中看到有提flowcell channel，与lane是一个意思吗？
A1: 是的。
Q2: 如果因为建库的原因导致测序结果不好，是否会重新建库？
A2: 如果是因为建库的原因导致测序有问题，是会重新建库再测序的。但是在测序前一般都
会有个QC的过程以保证建库的质量。
Q3: 完成项目提供最终数据后，华大能为客户保存数据多长时间？
A3:华大承诺在最终数据提供后，继续保留数据3个月，若甲方未在届满期前书面提出继续保存数据，将在届满期后自动删除，如果甲方在届满期前书面提出继续保存数据，则需签订补充协议并根据实际存储数据量与存储时间进行计费。
Q4:客户剩余样品在项目完成后能否返还给客户？
A4: 已完成项目后，甲方应在收到项目结题报告后60天内与项目管理人员联系协商样品处理事宜，如甲方逾期未与项目管理人员联系，剩余样品将会在项目结题报告递交甲方60天后由乙方按自己的方式全权处理。
Q5:剩余样品的定义是？
A5:剩余样品是指由甲方提供的原始样品（如DNA 、RNA、组织等）。由乙方进行测序过程中产生的中间产物（如胶块、文库等）除合同中有特别约定外，将不予返还。
Q6:样品返还的相关费用由谁承担？
A6: 如果甲方按照规定要求返还样品，乙方将根据甲方相关意见选择适当的运输方式及快递公司，但相关费用由甲方承担（该费用包括但不限于如干冰、包装、快递、保险等费用），且乙方不承担样品运输过程中可能存在的样本损坏、降解等风险。