人MHC捕获测序技术说明文档
1.产品背景和概述
1.1MHC简介
MHC（major histocompatibility complex，主要组织相容性复合体）位于哺乳动物某一染色体上的一组紧密连锁的基因群，其编码产物参与抗原呈递及诱导免疫应答[1]。人MHC位于第6号染色体短臂上（如图1），一般认为MHC区域从HLA-F基因开始到HLA-DPB1基因结束，大约3.37 Mb[2]。目前发现至少上百种疾病与此区域相关。人MHC区域具有高基因密度、高多态性、高度的连锁不平衡等遗传特性，与器官移植、自身免疫性疾病及多种复杂疾病和癌症具有相关性，亦可作为高度多态的遗传标记应用与群体进化研究[3]。
MHC系统作为高度多态性的遗传标志，使人类具有个体独特性，其抗原频率、等位基因频率、单体型组合和分布频率均成为区别群体中个体差异遗传基础的极好材料，并具有重要实际意义[4]。
图1.人MHC在染色体中的位置
1.2MHC区域的特点
1.基因密度高：该区域包括大约213个表达的基因，MHC区域基因密度：213/4M ≈53/Mb；而人基因组中平均基因密度：20000/3G ≈7/Mb[5]；
2.多态性高：多态性指在同一相互交配的群体中，同一基因座可编码两种以上的基因产物。HLA的多态性主要是由于复等位基因和共显性所致。HLA存在为数众多的复等位基因，每个基因座上的等位基因都是共显性[6]；
3.连锁不平衡：HLA多基因座位组成单体型时，连锁的基因不是随机组合在一起的而是某些基因总是较经常在一起出现，而另一些又较少地在一起出现。这种单体型基因非随机分布的现象称为连锁不平衡。
1.3人类MHC区域意义
1.MHC与器官移植：移植排斥反应的本质是免疫应答，故移植器官是否能长期存活关键取决于供者和受者之间的MHC型别是否相符，即MHC各基因位点上相同的等位基因数目是否相同。在肾脏移植中，各MHC座位配合的重要性依次为MHC-DR、MHC-B、MHC-A。在骨髓移植中，为预防移植物抗宿主反应，一般要求从同胞中选择MHC完全相同的个体作为供者。
2.MHC与疾病的相关性：目前已发现这一区域至少与人类的100多种疾病相关，包括甲状腺癌、瘢痕瘤、开角型青光眼、自闭症、贫血症、风湿性关节炎、小儿哮喘、男性不育等各类复杂疾病及癌症。携带某一特定HLA型别的个体会对特定疾病表现为易感性或抗性，如HLA-A1-B8-Cw7-DR3与Ⅰ型糖尿病、重症肌无力及系统性红斑狼疮相关；A26-B18-Cw5-DR3-DQ2与Ⅰ型糖尿病及格氏病相关[7]。
3.MHC与种族进化：MHC系统的多态性是人类进化的产物，因此各人种、各民族的MHC抗原分布、基因频率、单体型组合及频率能为研究种族和民族的起源、演变、进化和迁移提供极为有价值的信息，如对我国西双版纳傣族群体MHC-Ⅱ类的基因分析，发现DR、DQ、DP等位基因频率与连锁不平衡单体型明显有别于白种人及其他人种而具有该民族的独特性。
4.MHC与母胎关系：成熟的胎盘滋养层细胞不表达MHC-Ⅰ类抗原，从而保护了携带父方MHC单体型的胎儿不被母体排斥。另一方面，原因不明的习惯性流产也被认为与MHC有关。其机理可能是父母双方MHC相容性过弱，不能产生胎儿保护性抗体而使胎儿流产。
5.MHC与法医：由于MHC系统的高度多态性，在无血缘关系的人群中，MHC表现型完全相同者是极其罕见的。在同一家庭内MHC的遗传是以单体为单位从亲代遗传给子代，子代的两个MHC单体型各来自双亲一方。因此，借助MHC基因型或表型的检测分型技术，可以确定是否有亲子关系；在法医学上亦能判断罪行与某个体间的关系。
2.产品简介
2.1产品定义
MHC区域序列捕获技术是利用目标区域MHC区域序列设计探针，并通过捕获的方法将其富集，利用高通量测序手段对该区域DNA序列的变异进行分析。本产品研究的区域共计4.97 Mb；包含了传统MHC区域（约3.37 Mb）及其侧翼区域（约1.6 Mb），成功实现了对于常规扩增方法难以得到的高重复区域的高覆盖和有效富集。
2.2技术亮点
1.成功实现了对此区域的高覆盖（覆盖率：>97%，涵盖传统3.37 Mb MHC核心区域，并扩展了周围1.6 Mb区域）；
2.可对该区域中26个基因（A，B，C，DRB1，DQB1，DPA1，DPB1，DQA1，G，DMA，DMB，
DOA，DOB，DRA，E，F，H，J，K，MICA，MICB，P，TAP1，TAP2， V，L）进行HLA分型，该技术具有全球领先优势。华大推出的MHC产品与竞争产品有较大的不同，具体比较请见表1。
3.针对于该区域，可以找到与疾病相关联的SNP、InDel。
表1.捕获技术与其他技术比较
| 技术 | 人MHC捕获测序（BGI） | PCR+Sanger | 全基因组测序 |
| 可覆盖区域 | 高，能够覆盖97%以上的MHC区域，并包含侧翼区域 | 很低 | 高 |
| SNPs 检测准确性 | 可深度测序，检测准确性高 | 高 | 一般测序深度较低，检测准确性稍差 |
| InDels 检测 | 可以 | 无 | 有 |
| 价格 | 较低 | 少量样本及位点时便宜 | 较贵 |
| 综合 | 性价比高，适合大样本量,覆盖区域大，可以鉴定到26个基因的HLA型 | 性价比一般，适合于HLA个别基因分型且能扩增的区域 | 不能针对MHC做专门研究，性价比低，适合小样本 |
2.3MHC捕获测序应用
1.与HLA变异相关的自身免疫病及多种复杂疾病、癌症等的研究；
2.HLA精准分型-器官移植配型检测；
3.疫苗、药物等的靶向人群筛选；
4.亲子鉴定和法医学；
5.种族进化等。
3.研究流程
3.1实验流程
由华大基因和罗氏NimbleGen共同开发，采用NimbleGenSeqCap EZChoice Library定制型液相序列捕获产品，专门针对人MHC核心区3.37Mb及侧翼区1.6Mb进行捕获，成功实现了对常规扩增方法难以实现的高重复区域的高覆盖和有效富集。华大基因采用500bp建库策略，可将实际覆盖度提高至97%以上，达到4.85Mb，同时SNPs 变异位点检测的准确性也得到显著提升。
这个新方案可以轻松捕获和富集人MHC高重复性区域，克服传统PCR和基因组富集的方法的局限性，便于疾病和药物研究用。
图2. 人MHC捕获测序技术流程
3.2信息分析流程
1) 去除含接头及低质量的reads；
2) 使用比对软件将clean reads比对到人基因组；
3) 去除duplication；
4) 使用GATK进行局部重比对、碱基质量值校正；
5) 使用GATK检测SNP；
6) 使用GATK检测InDel；
7) 26个基因的HLA分型。
图3. 人MHC捕获信息分析流程
3.3信息分析内容
1.标准信息分析
1) 去除接头污染和低质量数据；
2)使用比对软件将clean reads比对到人基因组上，并统计产出数据（基于第1条）；
3)SNP检测，注释和统计（基于第1、2条）；
4)InDel检测，注释和统计（基于第1、2条）；
5)26个基因的HLA分型（基于第1、2条）；
2.高级信息分析
1)SNP，InDel与疾病的关联分析（基于第3、4条、基于群体）；
2)26个基因的HLA型别与疾病的关联分析（基于第5条、基于群体）。
4.送样建议、交付周期、交付列表
4.1 送样建议
表4. 送样建议和级别判断依据
| 建库类型 | 样品类型 | 检测方法 | 检测结果 | 判定结论 | ||
| Qubit | AGE | |||||
| MHC | 基因组DNA | Qubit, AGE | M ≥5μg | C≥37.5ng/μL | 没有降解或者轻微降解 | Level A |
| 2.5μg ≤M＜5μg | Level B | |||||
接受组织样品提取（相应的样品类型和提取方法请参考《合作伙伴送样建议》）。
人MHC捕获测序送样建议与Nimblegen EZ相同。
说明：
Level A：A类样品，指的是质量满足建库测序要求，且总量可以满足2次或者2次以上建库需要的样品。
Level B：B类样品，指的是质量满足建库测序要求，且总量可以满足1次但不足2次建库需要的样品。
4.2 项目执行周期
按标准流程（包含样品检测、样品建库、样品测序和标准信息分析），100个样本（平均深度80X）的人MHC测序项目运转周期约为50个工作日（不包括kit定制时间）。
表5. MHC芯片测序执行周期
| 样品量（个） | 芯片定制（天） | 建库及PE 91 测序（天） | 标准信息分析（天） |
| X ≤ 48 | 60 | 37 | 10 |
| 48 < X ≤ 144 | 60 | 44 | 10 |
| 144 < X ≤ 288 | 60 | 51 | 10 |
注：X代表样品个数
4.3 交付列表
1）产生不低于合同规定的clean data，fq格式；
2）比对结果文件，bam格式；
3）变异结果文件，vcf格式；
4）26个基因的HLA型别文件，type格式；
5）结题报告，pdf格式。
4.4验证方法
MHC捕获测序后可通过基因分型等技术来验证测序结果。
5.服务优势
1）BGI和NimbleGen联合研发：测试结果与基因分型SNP一致率高达99.42%，覆盖度达到97%。
2）首次全面覆盖MHC区域：总共4.97Mb，包含传统MHC区域3.37 Mb及1.6 Mb侧翼序列，并包含了8个单体型信息PGF，APD，COX，DBB，MANN，MCF，QBL，SSTO。
3）个性化信息分析方案制定：对于有特殊信息分析要求的客户，能根据客户需求制定个性化信息分析方案，信息分析团队会安排专人跟进，确保客户需求得到满足。
6.FAQ
Q1：MHC捕获试剂盒的捕获区域有多大？
A1：捕获区域共4.97 Mb，包含了传统的MHC区域（约3.37 Mb）及其侧翼区域（约1.6 Mb），以及8个单体型信息。
Q2：MHC捕获测序用的是哪个捕获平台？
A2：由于MHC捕获试剂盒是由BGI和NimbleGen联合开发，故捕获平台采用的是NimbleGen液相捕获平台。
Q3：MHC捕获测序目前只能做人的样品吗？
A3：人MHC捕获测序目前已成为标准化产品。至于其他物种，需要重新设计捕获探针后再做定制化目标区域捕获。
Q4：MHC捕获测序一般推荐多少深度测序？
A4：目前，我们一般推荐至少做80X以上。
Q5：我们的MHC捕获测序技术的coverage能达到多少？
A5：coverage可以达到97%以上。
Q6：BGI的分型准确率可以达到什么水平？
A6：分型至少可以达到四位数水平，主要依赖于现有数据库里的型别。分型准确率可以达到95%以上。
Q7：目前可以做哪些基因的HLA分型?
A7：可以做26个基因的HLA分型，包含A, B, C, DRB1, DQB1, DPA1, DPB1, DQA1, G, DMA, DMB, DOA, DOB, DRA, E, F, H, J, K, MICA, MICB, P, TAP1, TAP2,V, L。
Q8：BGI有相关MHC的发表文章吗？
A11：没有。但在2011年11月28日发布了题为“Roche NimbleGen and BGI Develop Advanced MHC Region Capture Technology for Human Disease and Biomedical Research”的新闻。
Q9：MHC的主要应用领域有哪些？
A13：与HLA变异相关的自身免疫病及多种复杂疾病、癌症等的研究；HLA精准分型-器官移植配型检；疫苗、药物等的靶向人群筛选；亲子鉴定和法医学；种族进化等。
7 参考文献
[1] Suenaga T, et al, Transport of misfolded endoplasmic reticulum proteins to the cell surface by MHC class II molecules.Int Immunol.2013,18.
[2] Vigneron N,et al.Identifying source proteins for MHC class I-presented peptides.Methods MolBiol. 2013, 960:187-207.
[3] Taflin C,et al. Study of the Allogeneic Response Induced by Endothelial Cells Expressing HLA Class II After Lentiviral Transduction.Methods Mol Biol. 2013, 960:461-472.
[4] Galili U,et al.Association between HLA determinants and complement receptors on human lymphocytes.Tissue Antigens. 1977, 10(2):99-107.
[5] Simons MJ. HLA genetics, immunity and disease.PNG Med J. 1978, 21(1):56-64.
[6] Bodmer WF.HLA: a super supergene.Harvey Lect. 1978,72:91-138. Review.
[7] Bodmer WF,et al.Genetics HLA: the major human histocompatibility system.Proc R SocLond B Biol Sci. 1978, 202(1146):93-116.