免疫组库测序产品技术说明文档

1.  产品背景和概述

免疫组库(Immune Repertoire，IR)是指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性B细胞和T细胞的总和。

人体淋巴细胞主要包括T细胞、B细胞。B细胞约占外周淋巴细胞总数的20%，其主要功能是产生抗体介导体液免疫应答。B细胞抗原受体((B cell receptor， BCR)是B细胞识别抗原的一种膜表面免疫球蛋白(SmIg)，具有抗原结合特异性。BCR由两条重链和两条轻链连接而成，其中重链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区及胞质区；轻链则只有V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，它们各由三个互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3）组成（图1），CDR的氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，在同一个体内，可高达10⁹～10¹²，构成容量巨大的BCR库，赋予个体识别各种抗原、产生特异性抗体的巨大潜能，这三个CDR均参与对抗原的识别，共同决定BCR的抗原特异性。

T细胞主要功能是介导细胞免疫。T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，大多数TCR由α和β肽链组成，少数T细胞的TCR由γ和δ肽链组成。每条肽链又可分为可变区（V区），恒定区（C区），跨膜区和胞质区等几部分，而α和β两条肽链的V区（Vα、Vβ）又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3（图1），其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。TCR的CDR3由V、D、J三个基因编码，在淋巴细胞的成熟过程中，通过V、D、J基因的重排形成了各种重组序列片段，再加上DNA碱基的SNP、Indel突变形成了T细胞的多样性。

图1. CDR互补决定区（CDR由CDR1、CDR2、CDR3组成，一般CDR3变化程度最高，CDR3由V、D、J三个基因编码）

综上所述，免疫组库拥有6种主要的肽链，分别为BCR的轻链和重链、TCR的α、β、γ和δ链。免疫组库中每一种免疫蛋白彼此间结构差异很小，但亚型种类繁多，正是这种多样性对健康起着至关重要的作用，免疫蛋白的亚型越多，越能有效抵抗病原体，亚型越少越容易感染疾病（图2）。除此之外，其它很多年龄、环境、疾病诱发以及用药等因素也影响着免疫组库的多样性（图3）。

V - J克隆匹配分布的3D图(健康状态)

V - J克隆匹配分布的3D图(疾病状态)

图2. 健康状态和疾病状态免疫组库多样性的对比（健康状态的免疫组库多样性很好；而疾病状态的免疫组库则多样性缺失，缺乏健康人应有的多样性。）

图3.影响人体免疫系统的因素及免疫应答过程

免疫组库测序（Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ)）以 T/B 淋巴细胞为研究目标，以多重PCR或5’RACE技术目的扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR区），再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。

2. 免疫组库的应用

免疫组库测序可应用于疫苗和医药的研发、生物标志物的发现、微小残留病(Minimal Residual Disease,MRD)检测、自身免疫性疾病的研究以及移植后监测等领域，例如在疾病特异的生物标志物的研究中，可通过高通量测序在患有同种疾病的人群中找到疾病特异性的CDR3，经过验证后的这些CDR3序列就可以作为代表该病的并可以从外周血中查到的Biomarker；自身免疫性疾病的研究如类风湿性关节炎，可以通过高通量测序识别潜在自体反应克隆来定量早期或已确诊的类风湿性关节炎的外周血的T细胞组库，作为早期诊断用药的依据；关于疫苗的研发，我们可以通过分析不同年龄段的人群注射疫苗后的效果来促进针对不同人群的疫苗研发；对于肿瘤研究，我们可通过比较患者用药前后免疫组库的变化来监测疾病指导用药，预防肿瘤复发。

图4.免疫组库的应用

3.华大科技免疫组库测序技术优势

1）一站式服务：提供从CDR的扩增、建库、测序、后续信息分析以及数据挖掘一系列全方位的服务

2）丰富的测序平台：可根据要求选择Hiseq2000、Hiseq2500或Miseq平台

3）富有针对性的研究方法：专门针对CDR3的V区及J区两端设计引物，目的扩增CDR3区域，其中的TRA、IGH、IGK/IGL都已经成功申请专利

4）高保真的扩增技术：采用多重PCR或5’RACE技术，实现不同克隆等效扩增， Unique克隆数高达10⁵

4. 研究流程

4.1工作流程

用淋巴细胞分离液分离外周血T/B淋巴细胞，提取DNA（或RNA），采用多重PCR/5'RACE对CDR3进行捕获（5'RACE还可以测CDR1、CDR2），通过 Hiseq2000（Hiseq2500、Miseq）平台进行高通量测序。

图5：展示免疫组库的研究对象、扩增方法以及平台选择

DNA水平选择多重PCR方法，侧重研究基因重组信息；RNA 水平可选择多重PCR或5'RACE方法，侧重于研究基因的表达状态。

表1. 多重PCR和5'RACE的比较

图6.免疫组库测序基本研究方法

4.2建库流程

多重PCR：在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。对于免疫组库测序，我们专门针对CDR3的V区及J区两端设计了一套引物。

图7.免疫组库建库实验流程（多重PCR方法）

5'RACE：即5'末端的快速扩增法，用特异性引物进行逆转录后，在cDNA的一链5'末端加入接头，进行二次无bias的PCR扩增，并通过亲和素磁珠富集，获得含目标区域的序列。

该方法使用的引物仅仅设计在C区一端，由于是快速扩增，所以产物长度范围较大。

图8. 免疫组库建库实验流程（5’RACE方法）

图9. 多重PCR扩增CDR3和5'RACE扩增CDR示意图

4.3测序策略：Hiseq2000一般推荐选择PE101。

也可根据项目实际需要选择不同平台和测序策略。

5. 信息分析流程

5.1信息分析流程图

采用华大自主研发的比对软件并过滤测序背景，将下机数据与IMGT免疫细胞受体库的V\D\J基因比对，搜索相应的基因片段，为确保结果的高准确度，在完成初步比对后，将比对序列再次与数据库做重比对，以寻找精确的V\D\J基因片段和序列的位点，统计分析VDJ基因频率，克隆频率分布，多肽序列数目等信息。

图10.信息分析流程图

5.2信息分析内容

5.2.1标准信息分析

1、基本数据统计

1）数据过滤，对原始数据进行去除接头污染序列及低质量reads的处理

2）数据搭建，数据拼接，消除测序背景及有效数据构建

3）数据统计，数据产出统计及测序数据的成分和质量评估

2、数据比对分析

1）比对分析，与数据库（IMGT）V/D/J基因片段比对

2）重新比对，寻找最佳V/D/J比对结果

3）比对结果分析，与数据库（IMGT）比对去掉无效序列（未比对、假基因、终止子、无开放阅读框）和Primer

3、序列结构分析

1）分析CDR序列组成及序列碱基成分

2）分析CDR序列的碱基插入和缺失

3）编码CDR序列翻译成氨基酸和肽链

4、免疫组库构建

1）构建免疫组库表达谱，统计多样性抗体库克隆表达情况

2）免疫组库多样性呈现，绘制V/J基因表达的2D、3D图

5.2.2定制化信息分析

可结合客户的需求，协商定制化信息分析内容

6. 送样建议、交付周期、指标

6.1送样建议和级别判定依据

DNA送样建议：

RNA送样建议：

接受血液、组织及细胞样品（PBMC）提取（相应的样品类型和提取方法请参考《合作伙伴送样建议》）

说明：

Level A：A类样品，指的是质量满足建库测序要求，且总量可以满足2次或者2次以上建库需要的样品。

Level B：B类样品，指的是质量满足建库测序要求，且总量可以满足1次但不足2次建库需要的样品

6.2交付指标及售后服务

按标准流程（不包括高级信息分析），100个样本的运转周期约为50个工作日。

6.3交付指标及售后服务    

1）产生不低于合同规定的clean data。

2）推荐数据量：Hiseq2000 PE100建议至少2G clean data/样品。

3）提交项目结题报告文档，说明项目完成情况。

4）测序过程中产生的序列文件*.fq（或*.fa）和相关生物信息分析结果文件，如果数据量小于50G，使用FTP服务器提供；因网络等原因无法顺利下载的，可直接传输至移动硬盘。如果数据量大于50G，所有数据将会使用移动硬盘传输数据。

5）数据交付6个月内，提供免费的项目咨询服务。

6）最终数据提供后，可继续保留数据1个月。

7. FAQ

1）什么是免疫组库？

免疫组库是以T/B淋巴细胞为研究目标，以多重PCR或5’RACE技术目的扩增决定B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）多样性的互补决定区（CDR区），再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。

2）免疫组库测序主要提供哪些方面的信息分析服务？

主要的分析内容有：基本数据统计、Contig长度分布统计、CDR3长度分布统计、序列结构分析、V-J匹配分布图和克隆表达谱分析。

3）关于各测序平台的适用范围？

Hieq2000：平台成熟，质量值高；读长较短，只能测CDR3。

Hiseq2500：测序速度快，可测PE100和PE150，PE150读长比PE100长；快速模式有项目周期优势。

Miseq：PE250有读长优势，可以测CDR1、CDR2、CDR3，有利于抗体改造等应用。

4）免疫组库的测序深度？能得到多少序列？

测序深度一般根据序列的多样性来确定，比如一次PCR可以获得10⁶种序列，而每一种序列平均表达在10左右，换算过来大概是20M reads，以Hiseq2000 PE100测序计算数据量则是2G clean data。

5）多重PCR与5'RACE的比较？

表1. 多重PCR和5'RACE的比较

8.文献

1.    M. M. Davis and P. J. Bjorkman, Nature 334, 395 (1988).

2.    Janeway CA Jr, Travers P, Walport M, et al. (2001). Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. Glossary: Garland Science.

3.Abbas AK and Lichtman AH (2003). Cellular and Molecular Immunology. 5th edition. Saunders, Philadelphia.

4.Frank SA (2002). Immunology and Evolution of Infectious Disease. Princeton (NJ): Princeton University Press;

5.Boyd SD, Marshall EL, Merker JD, Maniar JM, Zhang LN, Sahaf B, Jones CD, Simen BB, Hanczaruk B, Nguyen KD, et al. 2009. Measurement and clinical monitoring of human lymphocyte clonality by massively parallel VDJ pyrosequencing. SciTransl Med 1: 12ra23.

6.Freeman JD, Warren RL, Webb JR, Nelson BH, Holt RA. 2009. Profiling the T-cell receptor beta-chain repertoire by massively parallel sequencing. Genome Res 19: 1817-1824.

7.Robins HS, Srivastava SK, Campregher PV, Turtle CJ, Andriesen J, Riddell SR, Carlson CS, Warren EH. 2010. Overlap and effective size of the human CD8+ T cell receptor repertoire. SciTransl Med 2: 47ra64. doi: 10.1126/scitranslmed.3001442.

8.Klarenbeek, P.L. et al. Human T-cell memory consists mainly of unexpanded clones. Immunol. Lett. 133, 42-48 (2010).

9.Warren RL, Freeman JD, Zeng T, Choe G, Munro S, Moore R, Webb JR, Holt RA. Exhaustive T-cell repertoire sequencing of human peripheral blood samples reveals signatures of antigen selection and a directly measured repertoire size of at least 1 million clonotypes，10.1101/gr.115428.110 Genome Res. 2011.21: 790-797

编辑： gaowei2010    来源：丁香园