Western Blot 实验疑难问题解答
| 问题一：无电泳条带 | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 抗体用量不足 | 抗体对抗原的亲和力低。可提高抗体浓度（高于推荐浓度的2-4 倍） 抗体可能失活，做斑点杂交（Dot Blot）实验验证 |
| 蛋白上样量不足 | 提高跑胶时蛋白的上样量浓度。利用其它实验方法确定要检测的蛋白确实存在 做阳性对照（选取表达目的蛋白的合成蛋白，细胞系或处理后的细胞） 做斑点杂交（Dot Blot）实验验证 |
| 转膜不充分 | 预先将pvdf 膜/ 转印膜在转膜缓冲液中润湿 确保PVDF 膜与胶充分接触 |
| 转膜不完全 | 优化转膜时间。分子量大的蛋白往往需要增加转膜时间 确保转膜充分，用丽春红、酰氨黑和墨汁染膜 用预染的marker |
| 过度转膜 | 对于小分子量蛋白（< 10 kDa），降低转膜电压或减少时间 |
| 等电点 >9 | 用高pH 值的缓冲液体系，如CAPS(pH 10.5） |
| 二抗不正确 | 确认一抗的宿主品系和免疫球蛋白类型 |
| 抗体过旧 | 如果抗体过期或超过生产商所规定的使用期限，重新购买新鲜抗体 |
| 抗体保存条件不正确 | 按照生产商推荐的条件保存，禁止反复冻融 |
| 叠氮化钠污染 | 确保缓冲液不被叠氮化钠污染，否则会淬灭HRP 信号 |
| 一抗孵育时间不足 | 延长孵育时间至4℃过夜 |
| 问题二: 条带太弱 ( 信号低) | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 蛋白- 抗体结合不充分 | 减少洗涤步骤至最低限度 降低洗涤步骤中印迹缓冲液的NaCl 浓度（推荐为0.15M - 0.5M） 降低抗体溶液中NaCl 浓度（推荐为0.15M - 0.5M） |
| 抗体用量不足 | 抗体对抗原的亲和力低。可提高抗体浓度（高于推荐浓度的2-4 倍） |
| 蛋白上样量不足 | 提高跑胶时蛋白的上样量浓度 |
| 共轭物失活 | 将酶和底物混合，若无变色或颜色过弱，需重新配置或购买新的试剂 |
| ECL 效果减弱或过旧 | 购买新的ECL 试剂 |
| 脱脂奶粉可能会掩盖抗原表位 | 降低封闭液和一抗溶液中奶粉浓度或用3% BSA 代替 |
| 问题三: 整张膜布满不均匀的污点 | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 试剂污染 | 检查溶液是否被颗粒或细菌污染。重新配置新鲜溶剂 |
| 孵育或洗涤时溶液不足 | 确保在抗体孵育和洗涤时膜充分浸润 |
| 膜上出现气泡 | 轻柔去除膜上气泡，在转膜时尤其注意 |
| 孵育时振荡不均匀 | 确保摇床或振荡器均匀晃动 |
| 设备污染 | 确保电泳仪清洗干净。电泳设备中遗留的蛋白或胶碎片可能会粘附到膜上， 确保膜清洗彻底 |
| HRP 聚合 | 过滤共轭物去除HRP 聚合物 |
| 曝光时间过长 | 减少曝光时间 |
| 问题四: 出现杂带 | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 一抗非特异性结合 | 降低一抗浓度 降低跑胶上样蛋白量 用特异性强的单克隆抗体或经抗原亲和纯化的抗体（如R&D Systems 标识 为“MAB”或“AF”的抗体） |
| 二抗非特异性结合 | 做单独二抗的对照（不含一抗）。如果出现条带，需更换二抗 用特异性强的单克隆抗体或经抗原亲和纯化的抗体（如R&D Systems 标识为“MAB”或“AF” 的抗体） |
| 一抗或二抗非特异性结合 | 一抗或二抗溶液中加入 0.1 - 0.5% Tween® 20 用含2% 脱脂奶粉的印迹缓冲液作为母液稀释一抗和二抗。调整抗体浓度至所需浓度 提高洗涤次数 提高一抗印迹缓冲液中NaCl 的浓度（建议范围0.15M-0.5M），增加洗涤次数 提高洗涤印迹缓冲液中Tween® 20 浓度(0.1%-0.5%) |
| 检测物聚合 | 提高二硫苏糖醇使用量(20 -100mM DTT)，充分降低二硫键的形成。上样前蛋白在沸水中加热5-10 分钟 短暂离心 |
| 检测物降解 | 最大限度减少样本冻融次数 样本冻存前加入蛋白酶抑制剂 使用新鲜样本 |
| 试剂污染 | 检查溶液是否被颗粒或细菌污染。重新配置新鲜溶剂 |
| 问题五: 高背景 | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 一抗非特异性结合 | 用特异性强的单克隆抗体或经抗原亲和纯化的抗体（如R&D Systems 标识为“MAB” 或“AF”的抗体） 用5% 牛奶封闭。调整一抗缓冲液中牛奶（2-5%）或NaCl（0.15-0.5M）浓度 降低抗体浓度 |
| 二抗非特异性结合 | 做单独二抗的对照（不含一抗）。如果出现条带，需更换二抗 |
| 封闭不完全 | 在25mM Tris 溶液（Ph 7.4) 中加入5% 奶粉和0.1%-0.5% Tween 20,0.15-0.5M NaCl。延长孵育时间。调整牛奶浓度至最适浓度 4℃过夜封闭可能会降低封闭效率，因为去污剂在低温时可能作用不大 |
| 脱脂奶粉可能含有靶抗原 | 用3%BSA 代替 |
| 脱脂奶粉含有内源性生物素，与抗生物素蛋白/ 链霉亲和素不兼容 | 用3%BSA 代替 |
| 部分IgY 抗体可能会识别牛奶蛋白 | 用3%BSA 代替 |
| 洗涤不充分 | 提高洗涤次数 提高洗液中Tween 20 的浓度（0.1%-0.5%） |
| 一抗非特异性结合 | 提高一抗缓冲液和印迹缓冲液中NaCl 的浓度（0.15M-0.5M） |
| 曝光过度 | 减少曝光时间 如果靶标信号太强，等待5-10 分钟后重新曝光 |
| 问题六: 条带弥散 | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 蛋白上量过多 | 减少电泳时蛋白上样量 |
| 问题七: 白带 (ECL 显色) | |
| 可能的原因 | 解决方法 |
| 产生信号过强 | 降低抗体或蛋白的浓度。过量的抗体或蛋白会引起信号过强（通常会出现在单一条带处）。 这导致在相应位点底物消耗快速且完全。正因为反应完全后，无光信号产生，所以曝光时会 出现白带 |
