免疫学检测

条带呈笑脸状

凝胶不均匀冷却，电泳时中间比两侧更热

降低电泳时的电压

条带呈皱眉状

凝胶和玻璃挡板底部有气泡；两遍聚合不完全

电泳槽中加电泳液时排空玻璃挡板下方的气泡；配胶时充分混匀

拖尾

样本中蛋白溶解不好

上样前对样本煮沸 5 min，离心 1 min

出现纹理 
（纵向条纹）

样本中含有不溶性颗粒

上样前对样本煮沸 5 min，离心 1 min

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜；凝胶不均匀凝固

在未加样孔中加入等量样品缓冲液，配胶时充分混匀

条带弥散

上样时样品被电泳缓冲液稀释；浓缩胶配制出错或梳齿底部过短

上样时自底部往上缓缓加样；使用新配制 AP，按照配方配浓缩胶；梳齿底部至分离胶顶约 1.0～1.5 cm

条带宽窄不均

蛋白浓度不同，上样时体积差异过大

浓度高的样本中补充 1*上样缓冲液至各样本体积大致相同

没有阳性条带

一抗或二抗失效

更换抗体，选择现配现用工作液

一抗/二抗不匹配

更改为同种属及同亚型的抗体底物

发光液失效

更换新的发光液

标本中不含目的蛋白或目的蛋白含量太低

设置阳性对照，确定样本中是否含靶蛋白；增加标本上样量解决靶蛋白含量低

抗体染色不充分

增加抗体浓度；延长孵育时间

溶液中有辣根过氧化酶抑制剂

所有溶液和器皿中避免含有叠氮化钠

抗体活性降低

选择在有效期内的抗体；工作液现配现用，避免长时间放置

有阳性条带，但条带比较弱

样本中目的蛋白含量太低

增加标本上样量

洗膜过度

缩短洗涤时间

曝光时间过短

延长曝光时间

封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型

蛋白转移不充分

优化转膜条件；调整转膜时间；严格按照配方配制转膜液体；如为 PVDF 膜，需提前用 100% 甲醛浸泡

背景高

洗膜不充分

增加洗液体积和洗涤次数；洗涤液中加入 Tween-20

二抗浓度过高

降低二抗浓度

二抗的非特异性背景

不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源；重新选择二抗

封闭不充分

增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂

抗体与封闭蛋白有交叉反应

更换封闭剂；洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应

曝光过度 
检测过程中膜干燥

缩短曝光时间 
保证充分的反应液，避免出现干膜现象

非特异性条带（多条带）

抗体浓度过高

降低抗体（一抗、二抗）浓度

一抗的特异性不够

使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性

二抗的非特异性结合

不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源；重新选择二抗

蛋白上样量过大

降低上样量

蛋白降解

避免反复冻融；使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂

不同剪切体存在

分析不同剪切体的大小并核对

细胞传代过多，导致蛋白变异

使用原代或传代少的细胞作对照

背景有不均匀白色斑点

转膜过程中有气泡存在

仔细检查，避免存在气泡

抗体分布不均匀

孵育抗体时使用摇床