Western Blot 常见问题汇总分析

条带呈笑脸状 (︶)

凝胶不均匀冷却，中间冷却不好；迁移过快，电泳系统温度偏高。

条带呈皱眉状 (︵)

可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，

或者凝胶两边聚合不完全。

拖尾

样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）

样品中含有不溶性颗粒，电泳前将样品离心去除颗粒。

条带偏斜

电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散

加样量过多。

抗体浓度太高

一抗或二抗浓度太高会导致高背景，增加抗体稀释倍数。

一抗孵育的温度偏高

建议 4℃ 结合过夜。

使用的封闭液不兼容

对比不同的封闭缓冲液。

非特异性位点封闭不足

优化封闭缓冲液，最好的封闭缓冲液具有系统依赖性；

提高封闭液中蛋白的浓度；

优化封闭时间和/或温度；室温封闭至少 1 h 或者 4°C 封闭过夜；

在封闭液中加入 Tween-20，Tween-20 的终浓度为 0.05%。

封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应

换一种不同的封闭液；

不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素；

交叉反应的检测：封闭一张干净的膜，与抗体一起孵育，然后用超感应化学发光底物检测。

洗膜不充分

降低 HRP 结合物的浓度；

增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积；

如果洗涤液中无 Tween-20，添加 Tween-20 使其终浓度为 0.05%。

膜在实验过程中干过

实验过程中要注意保持膜的湿润。

选择的膜容易产生高背景

一般硝酸纤维素膜（NC）的背景会比 PVDF 膜低。

膜的曝光时间过久

缩短印迹膜曝光到胶片的时间；

在孵育过程中始终进行震荡。

膜被污染

小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合；

不能空手持膜，始终带干净手套或用镊子。

缓冲液污染或结块沉淀

制备新的缓冲液。

HRP 处产生聚集体

用 0.2μm 过滤器过滤结合物。

结合可产生斑点

用一种新的高质量的结合物。

缓冲液中有污染

使用新的缓冲液；

缓冲液使用前过滤。

操作设备被污染

保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外缘污染物；

保证在转膜后没有凝胶留在膜上，蛋白可能黏在胶上导致背景。

蛋白未转到膜上

转膜结束后，用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率；（注：总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。）

确保转膜过程中胶与膜完全接触；

确保转印夹层排布正确；

确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜；

确保转印部件在电印迹过程中未过热；

使用正对照和/或分子量 Marker；

可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流优化转印时间和电流。

蛋白未完全结合到膜上

在转膜缓冲液中加入 20% 的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜，需使用小孔径的膜进行。

一抗、二抗等不匹配

订购试剂时认真选取一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物；

可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。

一抗或/和二抗浓度低

增加抗体浓度；

延长抗体孵育时间；

抗体与靶蛋白的亲和力可能很小；

抗体可能失活；可用斑点印迹检测其活性。

一抗或/和二抗浓度太高

使用太多一抗或二抗可能导致底物迅速耗竭，呈现出很弱的信号；

至少成倍稀释一抗/二抗（可 4～10 倍）。

一抗失效

使用有效期内的抗体，分装保存，避免反复冻融取用，工作液现用现配。

过度封闭

使用含 0.5% 脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液；

试用不同的封闭液；

减少封闭时间。

洗膜过度

洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.05% 的弱去垢剂 Tween-20。

缓冲液中含有叠氮钠

叠氮钠是一种 HRP 的抑制剂，缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。

曝光时间太短

延长胶片的曝光时间（注意：超感应化学发光底物会持续发光至少 6 个小时）。

底物孵育时间太短

在使用超感应底物时需进行 5 分钟的底物孵育。

酶或底物失活

超感应化学发光底物和超感应 west 膜室温状态下化学底物可保存至少 12 个月，超感应免疫膜化学发光底物可保存至少 6 个月；

为衡量底物的活性，准备一个小量的工作液在一个暗室内，加入少量的 HRP 结合物，会观察到绿光。如果未检测到光，底物或 HRP 结合物均有可能失活；

确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降。

膜可以修复剥离重新用探针检测

在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性；

优化剥离程序；

如有必要可重新用探针检测；

避免在同一张膜上重复进行探针检测。

在膜上消解抗原

封闭底物可能含有蛋白水解酶活性（如明胶）。

印迹膜保存时蛋白降解

准备一张新的印迹膜。

细胞传代次数过多，使其蛋白表达模式的分化

使用原始或传代少的细胞株，或平行实验。

体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式：乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等，本身可以呈现多条带

查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

目的蛋白有其它剪切本

查阅文献或生物信息学分析可能性。

样本处理过程中目的蛋白发生降解

使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂；

样本处理时在冰上操作。

上样量过高，太敏感

适当减少上样量。

一抗不纯

使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带。

一抗或者二抗浓度偏高

降低抗体浓度，增加二抗对照 ；
选择特异性更强，只针对重链的二抗。

一抗特异性不高

重新选择或制备高特异性的抗体。

蛋白存在二聚体或多聚体

SDS-PAGE 电泳上样前，煮沸 10 min，
以增强蛋白质解聚变性。

膜上多处出现黑点或黑斑

转膜时有气泡或抗体分布不均

抗体与封闭剂结合抗体

尽量去除气泡，抗体孵育时保持摇动。

过滤封闭剂。

反白（条带显白色）

HRP 结合物浓度过高

至少成倍稀释一抗/二抗 (可 4～10 倍)。

靶蛋白分子量偏低或偏高

SDS-PAGE 胶浓度选择不合适

调整胶浓度，分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。