文献速递《Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding》

Published online January 29, 2020

2019 年 12 月下旬，中国武汉报道了由于一种未知的微生物而导致病毒性肺炎的患者。 随后鉴定出一种新的冠状病毒为致病性病原体，临时命名为 2019 新型冠状病毒（2019-nCoV）。截至 2020 年 1 月 26 日，已确认 2000 例以上的 2019-nCoV 感染病例，其中大部分生活在或曾前往武汉，已确认人与人之间的传播。

由中国国家重点研究发展计划，中国传染病控制与预防重大专项，中国科学院，山东第一医科大学资助，对来自 9 例住院患者的支气管肺泡灌洗液和培养分离物的样品进行了高通量测序（NGS），其中 8 例曾去过武汉的华南海鲜市场。 从这些个体获得了完整的和部分的 2019-nCoV 基因组序列。 使用 Sanger 测序连接病毒重叠群以获得全长基因组，其末端区域通过快速扩增 cDNA 末端来确定。这些 2019-nCoV 基因组和其他冠状病毒基因组的进化树分析用于确定病毒的进化史并帮助推断其可能的起源。 进行同源性建模以探索病毒的可能受体结合特性。

其中，国家 CDC 的基因测序策略如下：

通过 Sanger，Illumina 和 Oxford 纳米孔组合测序，从六个样品（WH19001，WH19005，WH19002，WH19004，WH19008 以及 YS8011）中获得了 2019-nCoV 的全基因组序列。首先，使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 直接从临床样品中提取病毒 RNA，然后使 用 SuperScript III 逆转录酶（ThermoFisher, Waltham, MA, USA）和 N6 随机引物合成 cDNA，然后用 DNA 聚合酶 I，Large (Klenow) Fragment（ThermoFisher）进行第二链合成。病毒 cDNA 文库制备使用 Nextera XT Library Prep Kit （Illumina, San Diego, CA, USA），之后使用 Agencourt AMPure XP （Bechman Coulter, Brea, CA, USA）磁珠纯化， 之后使用 Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer 定量。制备好的 DNA 文库，在 MiSeq 或 iSeq （Illumina）平台上进行测序，使用 300-cycle 的核心测序试剂盒。每个样本获得的数据量为 1.2~5GB。

使用先前描述的标准 (J Infect 2016; 72: 52-59) 过滤每个病毒样本的原始 fastQ 文件，然后使用 CLCBio 软件版本 11.0.1 重新组装。 还使用蝙蝠衍生的 SARS 样冠状病毒分离株 bat-SL-CoVZC45（登记号 MG772933.1）作为参照完成拼装。使用 CLCBio 软件进行 variant calling，基因组比对和序列插图，并通过 Sanger 测序确认组装的基因组序列。

根据制造商的说明，使用 Invitrogen 5'RACE 系统和 3'RACE 系统（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），对 cDNA 末端（RACE）进行了快速扩增以获得 5' 和 3' 末端的序列。设计用于 5' 和 3'RACE PCR 扩增的基因特异性引物，以从两个区域获得大约 400-500 bp 的片段。根据制造商的说明，将纯化的 PCR 产物克隆到 pMD18-T Simple Vector（TaKaRa，Takara Biotechnology，中国大连）和具有化学感受态的大肠杆菌（DH5α细胞； TaKaRa）中。 使用 M13 正向和反向引物对 PCR 产物进行测序。

 从 9 位患者获得的 10 条 2019-nCoV 基因组序列极为相似，显示出超过 99.98％的序列一致性。 值得注意的是，2019-nCoV 与 2018 年在中国东部舟山采集的两种蝙蝠衍生的严重急性呼吸综合征（SARS）样冠状病毒 bat-SL-CoVZC45 和 bat-SL-CoVZXC21 密切相关（一致性为 88％），但与 SARS- CoV（约 79％）和 MERS-CoV（约 50％）距离较远。进化树分析表明，2019-nCoV 属于 Betacoronavirus 属 Sarbecovirus 亚型，其最接近的亲属 bat-SL-CoVZC45 和 bat-SL-CoVZXC21 的分支长度相对较长，并且在遗传学上与 SARS-Cov 不同。 值得注意的是，同源性建模显示，2019-nCoV 具有与 SARS-CoV 类似的受体结合域结构，尽管某些关键残基处存在氨基酸差异。

2019-nCoV 与 SARS-CoV 的差异很大，可以被认为是一种新型的人类感染性β冠状病毒。 尽管我们的进化树分析表明，蝙蝠可能是这种病毒的原始宿主，但武汉海鲜市场上出售的动物可能是促进人类紧急感染该病毒的中间宿主。 重要的是，结构分析表明 2019-nCoV 可能对人类的血管紧张素转化酶 2 受体视而不见。 该病毒的未来进化，适应和传播仍旧需要紧急调查。

原文见以下链接：
https://www.thelancet.com/pb-assets/Lancet/pdfs/S0140673620302518.pdf

编辑： gaowei2010    来源：丁香园