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此前参加了BD公司在上海开的一个交流会议,感触比较多。加上自己最近刚开始接触流式,也遇到了很多困难,这一路走来也比较艰辛,所以特地把自己最近得到的一点点常识跟新手们分享一下,也希望高手们多给点建议。
一般情况,我们开始流式实验时,首先要选择抗体,必然要涉及到荧光的选择,尽量使这些荧光的补偿值降到最低。
1,我们需要了解我们用的流式细胞仪的硬件设施(激光,滤光片)
2,选择合适的荧光染料,尽量利用到你的仪器上的所有激光,这样可以使这些荧光交叉可能性达到最小。一般四种颜色或以下的比较好选,常用:FITC,PE,APC,Percp-cy5.5。当然还有其他很多种组合 我们也可以用BD或ebioscience网站上的软件进行选择http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp http://www.ebioscience.com/resources/fluorplan-spectra-viewer.htm 界面有点不同,但基本原理就是设置好你需要集中颜色,用的是哪台仪器,几根激光。。。软件就会自动列出合适的染料。
3,选择好荧光染料以后,就是将这些染料与你的抗体联系起来,这就要根据自己实验的需要了,有些常用的抗体上可能标记有很多种染料,但有些不常用的选择性就不太多,所以可以先定一些无法选择的抗体,然后就是根据表达量少的标记荧光信号强的染料,认为重要的抗体标记荧光信号强的,常用荧光的强弱如下:PE>APC>PE-CY7>Percy-cy5.5>FITC>APC-CY7。
4,抗体确定好后,就可以开始预实验了:包括样品的处理,抗体的浓度,时间,这些都需要一定的try。
5,正式开始实验需要做blank/isotype,单染(两两调补偿),复染(sample)。
关于抗体选择我还有个疑问,有个师姐将最好不好将PE-CY5和APC一起染,因为CY5可以被633激发,而我因为之前选抗体的时候不太懂,所以正好选了这两个,单染做出来的补偿还可以。有必要换抗体吗?
原文链接:http://immunotech.dxy.cn/bbs/topic/22284759?from=recommend&mode=old |