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CRISPR protocol---CRISPR 中 gRNA 的设计
这个在线站点功能比第一个丰富,可以选择基因编辑工具的其他用途(激活,抑制基因表达等)(图1-1)。下一步就是选择物种(图1-2)。但只有常见的 9 种。再下一步就是直接输入基因的名称(或序列)即可(图1-3)。
图1-1 选择编辑类型
图1-2 选择物种
图1-3 选择基因名称
但是出来的 sgRNA 位置有一些并不总在 ATG 的下游(图2所示,1,2,6,9,12,16,22 几条 sgRNA 位于 ATG 的上游)。所以根据位置,对于做基因的敲除(KO)而言,强烈建议选择 ATG 下游通常 100 aa 以内范围内的 sgRNA 来用(比如图3 中的 3,5,7,10 等较下游的);而且,一定要位于 CCDS 区域内(CCDS 是 consensus CDS,即公共的 CDS 区域,是针对很多个转录本 [isoforms] 定义,图2 中路色条框即是。这个很重要!!!)。
图2
Feng Zhang lab:http://crispr.mit.edu/。 这是最早的一个设计站点。包括常见的 16 个物种。选中物种,把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。但前提是你自己已经选好了位置(图3) 图3
http://www.rgenome.net/cas-designer/
这个站点内容更加丰富,比如物种覆盖式最多的,包括植物,昆虫等等(图4 左)。这个站点也是输入目的基因的序列定制的,不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。 图4
https://apps.thermofisher.com/crispr/index.html#/search 物种较少,商业性目的特别强,了解下即可。 图5
图6
一、手动版设计方法—好用不贵
手动版本虽然费事,但有时候却会事半功倍,节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说: 图7
序列中 PAM 和 sgRNA 的序列放大如下(前提是 sgRNA 位于 CCDS 区域,而且特异性要保证):
图8
也即我们常说的,让 Cas9 切割位置(确定的)跨过一个酶切位点(比如 sfcI)(在前两篇文章中都有所提及)。这样,在 Cas9 成功编辑靶序列产生 indels 的时候,酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图(图9):
图9 注意一点:PCR 引物设计的时候确保 PCR 片段内部不要出现第二个 SfcI 的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的(图10): 图10
对于 WT,酶切是充分的,不会残留。而对于成功编辑的两个 mixture:*1和*2,由于产生了 indels,部分 sfcI 的位点造到破坏,sfcI 切不动的。对于成功编辑的单克隆而言,应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可(图11,红色编号为阳性克隆)。
图11
TA 克隆结果(图12):
图12
打开页面,输入要编辑区域的基因组序列,然后在PAM类型里选择你需要的 Cas9 类型,比如 spCas9,saCas9 以及 cpf1 等。其他条件默认设置即可,然后点击 sunmit 即可。非常傻瓜式的操作(图12,13) 图12
图13
汉恒生物- Cas9试用装申请
方式一:点击链接申请Cas-9免费试用装!
http://www.biomart.cn/try/4041/CRISPR-Cas9基因敲除病毒试用装.htm |