快速脂质体转染
脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层,又称为人工生物膜。实验者曾运用脂质体来模拟生物膜,研究膜的构造及功能,从而发现了膜的融合及内吞作用,在细胞转染实验中经常用作外源物质进入细胞的载体。
脂质体(LR)试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物(1:1)。它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5-100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时,首先需要优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1-5ug和孵育时间6h,开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间(结果可参照表1所示)。 细胞种类:COS-7、BHK21、293E、SW480等均可作为受体细胞。脂质体本身会参与细胞生理活动,引起基因表达的上调或下调,因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24h为宜。 虽然人们早已发现脂质体对细胞有一定的影响,但由于一直没有更高效的转染方法来代替脂质体,所以脂质体转染试剂的选择非常重要。本人所用的转染剂为本人使用的是北京义翘神州的高效转染试剂Sinofection 0.75 ml,所用细胞为293Ecell。
1.转染前准备:将浓度1.5-4.5×104cells/L的293E细胞接种于板在 5%CO2,37℃条件下培养18-24h。 2.转染液的制备: (1)用无血清培养基于EP管中稀释0.2µgDNA至25μL,室温5分钟; (2)往DNA稀释液中加入sinofection至50μL,混合均匀,室温放置15 ~20min。 3.将转染液加入DMEM+10%FBS, 5%CO2,37℃孵化培养4-6小时; 4.基因表达是在48-72h后测试。 表1 不同细胞系sinofection用法(96孔板)
Cell type |
Culture medium |
Cells per well |
DNA |
Sinofection |
Medium change after 4-6h |
293H |
DMEM |
3×104 |
0.2µg |
0.5µL |
DMEM+10%FBS |
293FT |
DMEM |
3×104 |
0.2µg |
0.5µL |
DMEM+10%FBS |
293E |
DMEM |
3×104 |
0.2µg |
0.5µL |
DMEM+10%FBS |
293F |
DMEM |
3×104 |
0.2µg |
0.5µL |
DMEM+10%FBS |
COS7 |
DMEM |
1.5×104 |
0.4µg |
0.5µL |
DMEM+10%FBS |
hela |
DMEM |
2×104 |
0.3µg |
0.5µL |
1640+15%FBS |
Caco2 |
MEM |
3.5×104 |
0.3µg |
0.75µL |
MEM+10%FBS |
BHK21 |
MEM |
2×104 |
0.2µg |
0.5µL |
MEM+10%FBS |
CHO-DG44 |
DMEM+HT+pro |
2×104 |
0.5µg |
0.5µL |
DMEM+HT+pro +10%FBS |
RAW264.7 |
DMEM |
3×104 |
0.2µg |
0.5µL |
DMEM +10%FBS |
MCF7 |
MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat |
2×104 |
0.1µg |
0.25µL |
MEM/NEAA+0.01mg/mL insulin + sodium pyruvat+10%FBS |
SW480 |
IMDM |
3×104 |
0.4µg |
0.5µL |
IMDM +10%FBS |
MDCK |
DMEM |
4×104 |
0.6µg |
1µL |
DMEM+10%FBS |
CHO-K1 |
IMDM+Pro |
3×104 |
0.2µg |
0.5µL |
IMDM+Pro +10%FBS |
HepG2 |
DMEM |
3×104 |
0.5µg |
0.75µL |
DMEM+10%FBS |
A549 |
DMEM |
2×104 |
0.3µg |
0.5µL |
DMEM+10%FBS |
NIH/3T3 |
DMEM |
1.5×104 |
0.1µg |
0.75µL |
DMEM+10%FBS |
vero |
DMEM |
3×104 |
0.3µg |
0.75µL |
DMEM+10%FBS |
sf9 |
SIM SF |
5×104 |
0.4µg |
0.75µL |
SIM SF+10%FBS |
注意事项:注意保持 DNA量和ifectDNA体积比例( 1 μg DNA : 4 μL ifectDNA) |