关于肽核酸
肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一种人工合成的类似于 DNA 或 RNA 的聚合物。与多肽类似,各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基连接到主链骨架上。由于 PNA 不带负电荷,与 DNA 和 RNA 之间不存在静电斥力,因而结合的稳定性和特异性都大为提高。不易被 DNA 酶和蛋白酶水解,PNA 在体内以及体外极其稳定。
PNA 的主要应用
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- 序列特异性的 PCR 抑制剂(PNA 夹)
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- 端粒、着丝粒 FISH 探针,基因特异性探针,感染试验
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- 反义/抗微生物试剂
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- miRNA 抑制剂
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- 双链 DNA 侵入和捕获
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- 微阵列探针
非标记 PNA 由于其高亲和力和特异性,PNA 能有效结合靶核酸。未标记的 PNA 通常作为基因的 PCR反应的特异性阻断剂(PNA 夹)。这种技术可以有效地检测靶基因中的 SNP 突变。
PNA 倾向于定向且逆平行结合到靶核酸。PNA 5' 端的氨基(也写为 5' 或 H-),可以结合其它功能基团,PNA 3' 端的酰胺基(也写为 -NH2 或 3')反应活性弱。5' 端乙酰化可以阻止其继续发生反应。
因为 PNA 的解链温度 Tm 高于 DNA,一般情况下,大部分使用的 PNA 的长度为 10~21 个碱基。PNA 链越长,溶解性越差。嘌呤含量高(>60%)尤其是碱基 G,是导致溶解性差的原因。根据序列,PNA 链最大长度约为 40 个碱基。然而,我们强烈建议检查 Tm,设计探针应具有适当的长度和序列。
当 PNA 链较长(>22mer)或者嘌呤含量高(>60%)时,为了提高 PNA 探针的溶解性,我们建议在序列中加入一些助溶基团如 O linker、E linker、X linker 或者两个赖氨酸。当 PNA 偶联多肽或染料时,接头(linker)可以起到空间间隔(spacer)的作用。
• 可能用到的接头: - O linker(也称 AEEA 或 eg1):常用来提高溶解性 - 起到空间间隔作用:O、E、X、C3、C4、C6、C12 - 加入巯基:C6SH、C11SH
标记PNA
PNA链 5』端和 3』端均可以标记。由于 3' 端是非活性基团(-CONH2),所以需加入一个赖氨酸,其侧链上的氨基可以用来标记。
如果在 5' 端标记,我们建议在 PNA 和标记物之间加 1~2 O linkers。
标记物:荧光基团(—NHS 酯或羧基酰胺)、生物素、棕榈酸、DABCYL、叠氮化物、亚甲基蓝、巯基等。
<常见的荧光标记>
PNA 具体设计规则:
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- 长度: 合成 PNA 序列一般不超过 18 个碱基,但不包括接头、氨基酸和标记物。
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- 含有氨基酸: 可以把一个赖氨酸或半胱氨酸联在序列的 N 端或 C 端。
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- 嘌呤含量: 富含嘌呤 PNA 易发生聚合反应且水溶性差。为了避免聚合反应,请遵循以下原则:
1. 将嘌呤含量限制在 60% 以下。. 例如: GAT TAG CAG TCT ACG (可行- 嘌呤含量 < 60%)
2. 连续嘌呤不超过 4 个,而鸟嘌呤则不超过 3 个。 例如: ATT AGG GGC ATC TAC (不可行- 连续 4 个 G) CTA GAT AGA AGG TTC (不可行- 连续 6 个嘌呤)
3. 如果无法避免上述规则,可以考虑探针互补链。 例如: GTA GAT GCC CCT AAT (可行-上面序列的互补序列,未违背任何准则) GAA CCT TCT ATC TAG (可行-上面序列的互补序列)
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- 避免自我互补序列:反向重复、发夹和回文序列。由于 PNA/PNA 相互作用比 PNA/DNA 更强,这些类型的探针容易聚合。
1. 四个碱基互补是可行的, 但只含有 C 和 G 的除外。然而当它们被一个或多个碱基间隔时,也是可行的。 例如: GAT AATT GCA (可行 - 四个碱基互补) GAT CCGG TAC (不可行- 只有 CCGG 互补) TAT CCT GGT A (可行, CC, GG 隔了一个碱基)
2. 6 个及以上碱基互补是不可行的。 例如: CTA TTA ATG CA (不可行 - 6 个碱基互补)
3. 当被一个或多个碱基间隔时,6 个碱基互补是可行的,但只含有 C 和 G 的除外。 例如: AGT GCT ACT (可行 - 中间有间隔 ) GCG GCT CGC (不可行 – 只有 G 和 C 互补)
4. 即使被一个或多个碱基间隔,8 个碱基互补也是不可行的。 例如: ACTG T CAGT (不可行 - 8 个碱基互补)
一般规则:
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- 我们强烈建议您设计逆平行的 PNA 探针。PNA 可以在任一方向形成双链,但逆平行取向优先,形成最普通双链。对于反义和 DNA 探针类型应用,逆平行是最优先构象。当逆平行取向时,PNA 探针的 N 端相当于 DNA的 5』端。
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- PNA 熔点不同于 DNA。由于 PNA 链是不带电的,PNA-DNA 的 Tm 值会比相应 DNA-DNA 的高。通常情况下,100 mM NaCl 中,每增加一个碱基,其 Tm 值提高约 1 °C。在较低盐浓度下,其 Tm 值的差异将更加明显。通常,一个含 10 个碱基 PNA,其 Tm 值约 50 °C,含 15 个碱基的 PNA Tm 值约 70 °C。
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- 长度为 12~17 个碱基的 PNA 序列是最佳的。序列长度主要取决于其具体应用。与 DNA 的应用相比,PNA 探针序列需要的长度更短。链长的 PNA,根据序列,倾向于聚合,不易纯化和表征 。然而,序列越短,特异性越强。因此,对于短序列来说,不匹配的影响更大。
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