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一、反影(白色条带,黑色背景) *注1 其具体问题有二:一是背景较高,二是没有条带。 形成机制:条带处HRP很快将底物耗竭,则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则是原因3的现象。在暗室观察是否条带周围有荧光而条带处为暗。如是,则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片。否则一旦耗竭底物,通过减少压片时间,不能解决问题。也可以过一段时间HRP稍减后,重新加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,其原因和上所述相同,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带。 三、显影后膜上条带处变为黄色 *注2 其主要问题显影后膜上条带处变为黄色。 主要原因是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄。压出的X光片可能是正常的,或和原因1或原因3的现象同时存在,仅是一种表面现象,在压过的膜可以看出来。(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能还会消退,有时甚至刚加底物1-2min就可以看出来,所以要把握时机。)如果没有达到原因1和原因3的程度,那么一定能够看到很强的荧光,是一种良好的实验结果。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。如果因为荧光太强极易导致条带增粗变大,那么也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压10s-30s,甚至3-5s,根据结果在暗室进行调整。但也可能由于HRP浓度,无论怎么减少压片时间,条带都依然粗大;那么如果想获得漂亮条带,则必须通过降低抗体浓度来解决。原因1和3,如出现这样的情况,解决方法也是一样的。 二、信号弱或无现象 *注3 这是与1类似,但抗体特异性较好时的一种表现,经常与下面的原因4、5、6混淆,需要特别注意。在HRP极高的情况下,来不及压片就底物已耗竭,往往伴有原因2的现象。可通过加入底物后迅速进入暗室观察荧光确定,也可以根据原因2的现象确定,以区分于原因4、5、6。除非动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦底物耗竭,通过减少压片时间不能解决问题。也可待HRP稍减后,用TBST简单洗膜重新加底物压片。这种情况下,一抗、二抗稀释10倍以上,依然荧光明显。 *注4 提高抗体上样量以及下述的使用敏感底物/延长压片时间比较简单,在此不赘述。随抗体浓度增高,背景和非特异性可能会增加。一般而言,上样量的极限:对于裂解的混合蛋白,上样孔底面积(平方毫米)* 30ug = 极限上样量;而对于同一分子量的所有蛋白或仅做单一蛋白,则以0.3ug/平方毫米底面积作为极限上样量(见《抗体技术实验指南》的免疫印迹一章)。超过此量可能会导致条带变形。条带信号弱,可通过加大上样量、提高抗体浓度、使用敏感底物、延长压片时间解决。但因为这个极限上样量是确保所有分子量的条带都整齐的极限,而上样超量的表现是,随量的加大,变形的条带由低分子量逐渐往高分子量延伸。所以western极限上样量的真正操作标准是以目的条带不变形作为极限,比如对于150kd的蛋白,完全可以超出一般极限上样量的2倍而不变形(此时,中低分子量条带早已融合或挤为棒槌形了)。 *注6 测试HRP或底物活性:于暗室EP管加底物A、B液各500ul,加入1ul HRP偶联二抗,若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。 *注7 高背景原因是HRP偶联二抗结合到膜上,其原因包括直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗(主要指多抗中的杂抗体)间接结合、通过封闭物(与封闭物交叉反应)间接结合、洗脱不彻底等。在稀释抗体降低背景的同时,会降低对目的蛋白的结合效率,即以牺牲信号强度为代价。不过,还有一种与稀释抗体恰相反的做法——提高抗体浓度。这种办法适用于HRP结合到膜上较多而且底物相对极其敏感的情况。无论如何稀释抗体和加强洗膜都不能消除背景,或者条带和背景随稀释呈等比例递减甚至条带递减速度比背景还快,如果稀释抗体,则压片时间需延长而背景反而因此更加明显。这种情况下,需要提高抗体含量以提高条带显示程度,而背景随抗体浓度提高并不加强的很厉害。这样则可以通过减少压片时间而达到突出条带降低背景的目的。 |