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基因工程——实验服务
基 因 工 程
在基因工程服务部分,我们根据您的要求,可以单独地提供某项实验技术服务;也可以提供从项目分析开始,修饰基因、构建载体、诱导表达,直到得到您需要的目的蛋白高表达菌株,这样系统的实验服务。
我们基因工程实验平台主要为您提供以下服务:
钓取或拼接目的基因:
在基因工程里,对于来源于动物或人类组织的多肽或蛋白,要得到它对应的基因一般通过全合成、拼接或者PCR钓取的方式得到。 在要求忠实于天然状态的基因序列,或者考虑成本的情况下,用PCR钓取基因比较常见,即从组织总RNA中通过逆转录得到cDNA,并以之为模板进行扩增,得到目的基因; 对于基因长度不大于300bps的核酸片段来说,通过分段合成引物,用PCR的方式拼接全长基因也是一个不错的选择。相比全合成,能适当节省成本,而且可以自由选择合适的密码子,为在不同宿主中大量表达该基因做准备。
钓取或拼接目的基因
实验内容
a) 钓取目的基因:破碎组织或细胞样品,对其总RNA进行分离提取,并以总RNA为材料,反转录成cDNA后,以之为模板,用特异引物进行PCR扩增。得到目的基因后,构建T载体,并测序验证。
b) 拼接目的基因:根据基因序列和不同的表达载体,选择合适的密码子,合成引物,用PCR拼接目的基因。得到目的基因后,构建T载体,并测序验证。
实验材料
a) 需提供新鲜组织或细胞样品3-5mg,和目的基因核酸序列;
b) 需要提供设计过的目的基因的序列
实验器材
破碎仪,超声破菌仪、常规PCR仪、恒温培养箱、摇床等
实验时间
3—5个工作日
实验说明
得到组织总RNA,cDNA和纯化后的PCR产物,提供总RNA、PCR产物的电泳图片,以及带有目的基因的T载体质粒,和测序报告
实时荧光定量PCR(realtime-PCR):
实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离。 我们的该项服务使用的荧光染料是SYBR Green。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中。从经济角度考虑,它也比其它的探针的价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合,所以一旦反应体系中出现非特异扩增,那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素,可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。
实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)
破碎组织或细胞样品,对其总RNA进行分离提取,并以总RNA为材料,反转录成cDNA后,以之为模板, SYBR Green作为染色剂,对照管家基因的标准曲线,实时、定量检测样品的目的基因。可开展对特异病原体DNA或RNA进行直接定量分析、基因表达研究、免疫T细胞群体V-β组分分析、基因多态性研究和基因突变分析等。
需提供新鲜组织或细胞样品100mg,或提供cDNA模板和基因序列
破碎仪,超声破菌仪、荧光定量PCR仪(型号:Corbett RotorGene 6000)
得到定量结果及彩图、实验报告等
目的基因的表达及筛选:
基因工程的核心是要选择一套方便的系统,来大量生产出结构正确、有活性的目的蛋白。这里面包含着两个重要的工作:一个是选择合适的质粒载体、一个是选择合适的表达宿主菌。 由于不同基因在序列上的特点各有差异,所对应的蛋白的理化性质上更是千差万别,在面对众多的基因工程工具的时候,如何找到正确的表达系统是一项繁杂和不确定性很高的工作。 而给目的基因选择合适的质粒载体和合适的宿主菌,不仅能够关系到上游蛋白的活性和表达情况,更关系到下游大量培养工程菌后蛋白的分离纯化的难易,因此需要实验工作者对整个上游工作进行细致地分析和全方位的把握。
目的基因的表达及筛选
a) 根据需要,可以构建不同的表达载体,包括大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统、哺乳动物细胞表达系统等。并对克隆进去的基因进行测序。
b) 将外缘基因(质粒)转入大肠杆菌、酵母菌中,根据筛选标记,基因表达情况,找出阳性克隆。
需提供目的基因片段,和目的基因的核酸序列等相关资料
低温高速离心机、常规PCR仪、凝胶成像系统、电转仪、摇床、培养箱等
10--30个工作日
a) 得到带有目的基因的质粒载体储存液,和相应的菌种,以及目的基因的全长测序报告和相关的核酸电泳相片;
b) 得到目的蛋白的高表达菌株或细胞株,以及相关电泳图片。
DNA(DNA vaccine)疫苗的构建:
DNA疫苗,是近年来基因治疗研究中所衍生并发展起来的一个新的研究领域。它是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内,使外源基因在活体内表达,产生的抗原激活机体的免疫系统,从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。该疫苗既具有减毒疫苗的优点。同时又无逆转的危险,因此越来越受到人们的重视,被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。
DNA(DNA vaccine)疫苗的构建
将抗原基因插入到指定的真核质粒表达载体中,以大肠杆菌作为寄主,扩大培养后,大量提取质粒,进行纯化、包装后保存
需提供蛋白质抗原的基因,以及载体要求、包装条件等
低温高速离心机、凝胶成像系统、摇床、培养箱等
10--15个工作日
得到带有纯化后的目的基因的质粒载体储存液,和相应的菌种,以及目的基因的全长测序报告和相关的核酸电泳相片;核酸浓度在毫克级以上.
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