Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒产品应用:用于细胞凋亡检测
产品介绍:
一、原理
在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记,以标记了的Annexin V作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。
二、试剂盒组份
组份
|
10次 |
20次 |
50次 |
100次 |
Annexin V-FITC |
20μL |
40μL |
100μL |
200μL |
Binding Buffer |
5 mL |
10.0 mL |
25 mL |
25 mL×2 |
Propidium Iodide (PI) |
50μL |
100μL |
250μL |
500μL |
三、
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒操作步骤
1、悬浮细胞离心(离心2000rpm,5min)收集;贴壁细胞用
不含EDTA的胰酶消化收集,(注胰酶消化时间不易过长,否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合)
2、用PBS洗涤细胞二次(离心2000rpm,5min)收集1~5×105细胞;
3、加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞;
4、加入2μL Annexin V-FITC混匀后,加入5 μL Propidium Iodide,混匀;
5、避光、室温反应5min;
根据不同的分析方法选择步骤A或B。
A、荧光显微镜观察
1、滴一滴经过步骤1~5处理过的细胞悬浮液于载玻片,并用盖玻片盖上细胞;
2、对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;
(1)将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;
(2)用PBS洗涤细胞两次;
(3)在500μL 的Binding Buffer中加入2μL Annexin V-FITC, 5 μL Propidium Iodide,混匀;
(4)将上述溶液滴加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖;
(5)避光、室温反应5 min。
3、将盖玻片倒置于载玻片上,于荧光显微镜下观察;
Annexin V-FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色。
B、流式细胞仪分析
用流式细胞仪检测(Ex=488 nm; Em=530 nm)细胞凋亡的情况。(绿色荧光通过FITC通道通常为FL1来检测;红色荧光通过PI通道通常为FL2或FL3来检测)
四、
Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒注意事项
- Annexin V-FITC,Propidium Iodide (PI)避光保存及使用。
- Propidium Iodide (PI)有毒,操作时要戴手套。
五、储存置于4ºC,可保存一年
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