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ICAT (Isotope-coded affinity tag )服务

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上海中科新生命生物科技有限公司
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提供商: 上海中科新生命生物科技有限公司
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服务名称: ICAT (Isotope-coded affinity tag )
简介: ICAT (Isotope-coded affinity tag )服务

原理该技术由Gygi等 提出,它主要是使用了一种称为ICAT的化学试剂。其结构主要由3部分构成:(1)亲和标签(生物素,biotin),用来分离ICAT标记的多肽;(2)连接子,用来整合稳定的同位素;(3)活性集团,用来特异结合巯基(半胱氨酸).

试剂有两种形式,称之为“重”(连接子含有8个氘原子)和“轻”(连接子含有8个氢原子);由8个氢原子或8个氘原子分别标记的ICAT分子量正好相差8。
当不同状态的细胞被裂解后,分别加入不同标记的ICAT与总蛋白质反应。
ICAT的反应基团会专一与蛋白质中的Cys共价结合,待充分反应后,将二者等量混合,再用胰蛋白酶酶解,HPLC分离,就可对含生物素ICAT酶解片段进行串联质谱分析。
一对ICAT标记来源不同细胞状态下的相同肽段总是一前一后相邻分布在质谱图上,且分子量正好相差8或4 D(肽段带两个电荷)。
通过MS/MS鉴定出该片段属于何种蛋白质后,计算二者峰值的差异,就可知这种蛋白质在二种细胞状态下表达的情况。
Biomedical Node of the Australian Proteome Analysis Facility的网站中有关于DIGE原理的动画。如有兴趣,可以从以下链接浏览http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/ICAT/ICAT.html
优点: ICAT具有广泛的兼容性,主要表现在:(1)能够兼容分析任何条件下体液、细胞、组织中绝大部分蛋白质;(2)烷化反应即使在盐、去垢剂、稳定剂(如SDS、尿素、盐酸胍等)存在下都可进行;(3)只需分析含Cys残基的肽段,从而降低了蛋白质混合物分析的复杂性;(4)ICAT战略允许任何类型的生化、免疫、物理的分离方法,因此能很好地定量分析微量蛋白质。
仪器: Finnigan LTQ

我们发表的论文 Jiang XS, Dai J, Sheng QH, Zhang L, Xia QC, Wu JR, Zeng R. A comparative proteomic strategy for subcellular proteome research: ICAT approach coupled with bioinformatics prediction to ascertain rat liver mitochondrial proteins and indication of mitochondrial localization for catalase. Mol Cell Proteomics. 2005, 4:12-34.pdf

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氨基酸是蛋白质合成的基本元件。Lys(K)、Arg(R)是哺乳动物细胞的“必需氨基酸”,须在培养基中添加K和R,便于细胞进行蛋白质合成,促进细胞增殖。天然的K和R分子中,都含有6个C原子,这些C原子全部是12C(12C6-K、12C6-R)。将普通K和R中的6个12C原子全部用13C取代,则生成13C标记的K和R(13C6-K、13C6-R)。13C6-K和13C6-R要比相应的普通K和R(12C-R、12C-K)在质量上增加6Da。我们将普通的K和R, 记为K0, R0; 13C6-R和13C-K6,记为K6, R6。 SILAC(Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture)技术就是利用哺乳动物细胞生长对K和R的依赖原理,将K6、R6加入细胞培养基中,在细胞进行蛋白质合成时,K6、R6自然被“掺入”到蛋白质中。通过>6代的细胞增殖,整个细胞的蛋白质都会被K6、R6所标记,从而将6Da的质量差异引入到了蛋白质的K和R氨基酸上,成为后续MS定量的基础。 比如,要比较2组细胞的蛋白质表达谱的差异,将一组细胞用普通培养基培养(K0R0, Light,L),一组细胞用SILAC培养基培养(K6R6,Heavy,H)。分别提取蛋白质,1:1等量混合后进行SDS-PAGE电泳。将相应的SDS-PAGE条带切下后,用trypsin进行酶解,生成以K和R结尾的肽段。对于2组样品中的同一个蛋白质的、同一条肽段,它们之间有6Da的质量差异。该6Da的质量差异,在高分辨率的MS中能被有效区分出来,呈现出一对同位素质谱峰(paired peaks),质谱峰的信号强度的比值代表该肽段(蛋白质)在2组细胞中的表达水平差异比值,从而实现对蛋白质表达水平的相对精确定量; 利用SILAC技术结合LC-MS能够定量比较细胞在不同状态下的蛋白质组差异(nornal vs. treatment),通过MS的定量信息,快速筛选差异表达的蛋白质(不变、上调和下调)。同时将SILAC与Co-IP/pull-down等技术结合,能进行蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰等定量分析,快速筛选特异性的相互作用和翻译后修饰的相对程度等; SILAC实验从最源头引入质量差异,最大程度的降低了实验系统误差,定量信息丰富,准确度高。SILAC技术“
同位素标记磷酸化蛋白质组学技术Isotope labeled quantitative phosphoproteomics technology1、技术简介磷酸化是生物体内存在最为广泛的一种蛋白质翻译后修饰,可以发生在约1/3以上的蛋白质中,对各种细胞过程和生命活动如信号转导和细胞周期等起着重要的调节作用。蛋白质磷酸化参与调节细胞多种生命活动过程,包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架调控、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩、新陈代谢等。因此,分析蛋白质磷酸化修饰在不同生理病理状态下的相对量的变化,可进一步发掘与疾病发生发展相关的重要生物标志物,为揭示其分子机理奠定基础。近年来,随着以液相色谱-质谱连用技术为核心的“鸟枪法(shotgun)”蛋白质组学的快速发展,磷酸化肽段/蛋白质富集及预分级技术的进步,磷酸化肽段质谱裂解方式,高速扫描高质量精度质谱以及磷酸化肽段定性定量相关软件的巨大发展,均为大规模,高通量的磷酸化蛋白质组学分析奠定了基础。目前,对蛋白质组磷酸化进行规模化全面分析已经成为现实,在保证试验结果的可靠性和准确性的同时,在一次试验中即可对成千上万个磷酸化位点同时进行分析表征。2、技术原理同位素标记磷酸化蛋白质组学(Phosphoproteomics)技术通过巧妙的将iTRAQ标记试剂与磷酸化肽段高效富集相互结合来达到对磷酸化肽段(蛋白质)同时进行定性和定量的目的。在本实验中,经过蛋白质提取(Protein Extract)获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解(Trypsin Digestion)成肽段,iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记(iTRAQ定量原理见服务2中技术原理部分)。标记混合之后的肽段经过富集得到磷酸化肽段。目前,固相金属离子亲和层析法(IMAC),强阳离子交换色谱法(SCX),金属氧化物亲和色谱法以及抗体法是几种常用的磷酸化肽段分离和富集方法。本实验将选用操作简单,富集效率高的二氧化钛(TiO2)进行磷酸化肽段的富集。TiO2富集法是目前最为成熟的金属氧化物富集法。TiO2在不同的pH值下,可以表现为路易斯酸或路易斯碱。在酸性条件下,钛原子带正电表现为路易斯酸,可以与阴离子结合;在碱性条件下,则表现为路易斯碱,可以与阳离子结合。这样磷酸化肽段的磷酸基在酸性条件下与之结合,碱性条件下洗脱达到富集磷酸化肽段的目的。
一、Label-free技术简介    蛋白质非标记定量技术(label-free)是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准,只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。Label-free的技术优势就在于蛋白质不需要进行标记,所需样品总量少,耗费低。 二、技术原理         非标记定量蛋白质组学已成为越来越重要的质谱定量方法,按照其原理主要分为两种:  Spectrum counts类的非标记定量方法:发展比较早,已经形成多种定量算法,但主要原理都是以MS2的鉴定结果为定量基础,各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。  另一种非标记定量方法的原理是以MS1为基础,计算每个肽段的信号强度在LC-MS色谱上的面积积分。 三、实验流程 四、应用特点● 对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高。 ●无需昂贵的同位素标签做内部标准,实验耗费低。 ●对样本的操作也最少,从而使其最接近原始状态,并且不受样品条件的限制,克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。   同位素标记 非同位素标记 样本标记同位素 样本非标记 样本量限制,ICAT(2),iTRAQ(8)等 样本无限制 在大样本过程中,难于跟踪蛋白丰度 易跟踪蛋白丰度 多数肽段难于识别 能够识别大多数肽段 难于识别和定量低丰度蛋白 能够鉴别低丰度肽段 需提前进行二级质谱蛋白鉴定 可以鉴定差异后再进行二级质谱蛋白鉴定 实验重现性高 实验重现性低  五、信息分析  表 图 差异基因列表 样本之间相关系数热图 上下调基因表 层次聚类热图 差异基因数目比较表 主成分分析图 上下调基因数目比较表 K-均值聚类图 鉴定蛋白理化性质表 GO功能富集图 K-均值聚类类别表 差异基因火山图

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