引物设计中可能被忽略的几个细节:1. 引物的GT含量对形成引物二聚体有很大影响。2. 引物的退火温度和GC含量并不是严格正相关。3. 设计引物时,应尽量使引物5‘端稳定,3’端不稳定.
发表于2009-04-13 10:33
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引物设计重点考虑因素主要有:GC含量,多义性,3 末端稳定性,GC钳,二级结构,发卡结构,二聚体,错配。
发表于2007-07-14 16:35
PCR引物设计大概思路:不管你的基因是什么正链或负链编码的,你只要将其编码蛋白的mRNA序列写下来,然后你的上游(5'端)引物就从ATG开始与其完全一直就行了,大约有15-18个完全匹配的碱基就足够了,再在你的5'端加上BamHI的序列及两个保护碱基就可以了;你的下游引物就取与mRNA的终止密码(最好将终止密码包括进去)前15-18个碱基序列,写出其反向互补配对序列,再在方向互补候的序列的5'端加上SmaI的序列及3个保护碱基就可以了。
发表于2004-07-31 01:37
引物设计要注意的几个地方:发夹结构,反向配对,GC含量(40-60%),退火温度(45-65度),引物长度(18-27bp),3' 端最好是C、G(提高结合度),引物在序列中的错配位点。
发表于2004-07-26 22:37
设计引物扩增目的片断,上游引物序列为:GGCCCAGCCGGCC ATGGTGTTAAGTCTTCTGTA(空格前为酶切位点),扩增产物与T载体连,测序正确,但峰形不好,即在GTT之间有个大C峰,之后酶切与另一载体连接,测序总是在ATGGTG后多了一个G,解答到期是引物的问题,导致PCR扩增时发生突变,还是引物合成的问题。
发表于2007-03-24 00:41