mylx99
发表于 2004-07-26 20:19
1.细胞核蛋白提取:取约8.8×106个HSC-T6细胞,5ml PBS/Phosphatase Inhobitors冲洗,收集细胞。加入0.25 ml 1×Hypotonic buffer重悬,冰浴15min;加入25μl NP-40,震荡10s;14000×g离心,30s,4℃;收集上清即胞浆蛋白,于‐70℃保存。将沉淀重悬于50μl Lysis buffer(含DTT和Protease Inhibitor Cocktail)中,震荡10s;置于摇床中冰浴30min,150次/min;再次震荡30s,14000×g离心,10min,4℃;取上清即为核蛋白,于‐70℃保存,测定蛋白质浓度。
2.寡核苷酸探针的标记和纯化:
rat :NF-κB:5′AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3′
取寡核苷酸探针双链各5μl,稀释为100μl (终浓度10PM);97℃加热15min,室温冷却,37℃孵育45min。配制如下反应体系:
10×buffer 2μl
2.5 mM dNTP(无d ATP) 3μl
寡核苷酸DNA 1μl
[α-32P]dATP 4μl
ddH2O 8.5μl
Klenow Fragment 1.5μl (6U)
37℃孵育60min。将标记的探针加入用STE预湿润的Sephodex-25 DNA纯化柱,加入TE 70μl,加压收集液体于EP管中。取1μl测放射性比活度。
3.聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影:
(1)配制8%聚丙烯酰胺凝胶
10×TBE 5ml
30 % 丙烯酰胺 10 ml
10 % 过硫酸胺 0.6 ml
TEMED 0μl
ddH2O 35 ml
电泳液为1×TBE
(2) 配制反应混合液:
0.2 M Tris?Cl 1μl
1M NaCl 1μl
10 mM EDTA 1μl
10 mM DTT 1μl
20 mM MgCl2 1μl
2 ng/μl Poly dIdC 1μl
25 % 甘油 3μl
[α-32P]dATP 1μl (不低于5万μCi)
取5μg核蛋白,加入反应混合液,ddH2O补足20μl总体积。冷探针:加入1μl 20 PM未标记探针。Supershift:加入NF-κB p65 抗体1μg,室温下孵育45min。8%聚丙烯酰胺凝胶预先电泳30min后上样,100V电泳约3h。小心取下胶,吸附在滤纸上,表面用保鲜膜覆盖。干胶仪干胶40min,暗盒中压3-4张胶片,‐70℃冰箱中放射自显影2-3天,冲洗胶片。