ahming
发表于 2004-07-01 22:27
我的电击转化方案:
电穿孔转化
1. 取50ul到100mlYPAD中,30℃ 250rpm摇床过夜,菌浓度达到2.5×107cells/ml。
2. 室温3500rpm离心10min。
3. 用25ml的(100mM LiAc/10mM DTT(dithiothreitol)/TE重悬沉淀,室温放置1h。
4. 4℃ 3500rpm离心5min。
5. 25ml冰水重悬,重复1次。用10ml 冰的1M 山梨糖醇(sorbitol)重悬。
6. 4℃ 3500rpm离心5min。小心移去上清。
7. 用100ul 1M 山梨糖醇重悬,置冰上待用。
8. 取40ul(约4~8×108cells)到电转化池,加DNA (1ug、0.1ug 最大体积5ul),放冰上5min。
9. 电转化:0.2cm的电转化池放入槽中,1.5kV,25uF,200瓯。(对照:不加DNA。)
10. 电击后马上取出加入1ml 1M 山梨糖醇。
11. 涂布于SD平板。30℃培养3~5天。