myddouou
发表于 2008-05-06 22:06
我也是研一的时候做感受态制备和质粒转化,开始也是摸不到头绪。现在终于可以帮帮别人了。介绍一下自己的经验
我制备大肠杆菌感受态是完全按照分子克隆上的氯化钙法做的,效果不知道,因为用了一次自己做的以后就用买的了。买的是天根公司的。
现在做转化比较多,首先要做三管,样品一管,阳性和阴性对照各一管。取感受态细胞和质粒的量没有严格的要求,比如分子克隆上说200微升感受态加10微升质粒,我开始也是这样用的,但菌落长的很密集,只能在培养基的边缘找过极少的单克隆。我现在用的是20微升感受态加1微升质粒,菌落完全可以达到要求。感觉应该是根据你的质粒的浓度自己调整用量吧。
我一直用的是42°C休克90s,其他的有人说可以30s,没有试过。
分子克隆说复苏时用SOC培养基,我一直用的是LB。
我一般是今天下午6:30左右做完,放37°C培养箱培养,次日8:30左右去看菌落的生长情况。
特别提醒一点:务必弄清楚你的质粒的抗性是哪个,我就是在这个上走了弯路把氨苄青霉素错用成了氯霉素。切记切记!