细胞蛋白裂解液,洗脱液:
PBS及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl: 8g
KCl: 0.2g
Na2HPO4: 1.44g
KH2PO4: 0.24g
加入800ml蒸馏水,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可,高温高压灭菌,4℃保存备用。
PMSF(苯甲基磺酰氟) MW:174.19 工作浓度0.1-1mM,这里使用1mM,储存浓度100mM,将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可。保持于-20℃或者4℃。
(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)
1、原核融合蛋白A的获得
(1)将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株
(2)挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里,37℃培养过夜
(3)将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中,37℃,225rpm培养至OD600≈1.0-1.5左右,加入适当浓度的IPTG,在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整),6000g,10分钟,4℃离心收集细菌,去尽上清,将菌体至于-20℃放置O/N
(4)室温冻融菌体,马上置于冰上,每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液(PBS+1%Triton-100+PMSF),吹打混匀
(5)冰上超声破碎,开2秒,停9秒,总40-60分钟。至裂解液充分清凉
(6)11000rpm,15分钟,4℃离心分离上清, -80℃保存备用
2、真核融合蛋白B的获得:将编码B蛋白的碱基序列克隆到编码标签蛋白(如HA,或者myc)的真核表达载体上,进行细胞转染。
3、48小时后,取适量融合蛋白GST-A冰上冻融
4、取50-70ulGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中,用800ul PBS+1%Triton-100润洗一次,将冻融融合蛋白GST-A与之混匀,4℃层析柜旋转结合1小时。
5、PBS+1%Triton-100洗3次,PBS洗3次。留取20ul( PBS+Beads)作Offer。
6、同时,裂解真核融合蛋白B,去尽培养基,用PBS(RT)洗一次,加入300ul裂解液(以6well为例,PBS+1%Triton-100+ Cocktaier),4℃放置30分钟。
7、吹打收集至1.5mlEP管,超声破碎。13000rpm,15分钟,4℃离心取上清。
8、BCA蛋白定量(optional)留取20ul做Offer,其余样品加入到已纯化蛋白的EP管中,用PBS补足液体到600ul左右,以便蛋白之间能充分结合!4℃旋转结合O/N9:PBS+1%Triton-100洗3次,PBS洗3次。
9、40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白,煮沸3分钟,高速离心,Run –SDS PAGE做Western Blot检测。用HA或者myc Blot。 |