内参可以做出来的话,基本可以排除蛋白的问题。可能的问题有1,蛋白本身表达少,为痕迹量蛋白,要提高上样量,1.0mm的板最多上样50uL,1.5mm板最多上样75uL.所以你只能提高蛋白浓度了,一般浓度在4ug/ul是比较理想的,细胞蛋白的话一般在2ug/ul.2,蛋白转过去没,30KDa以下一般认为是小分子,一般要用0.22um的膜,0.45um的膜转膜时间过长可能把小分子蛋白转丢了。3,抗体的问题,选错抗体,种属来源错误(一抗或二抗都有可能),抗体本身不适合做western blot,这个产品说明书上应该有些写的。4,抗体浓度过低,孵育一抗时间过短,最好是4℃过夜,一般12-14小时。5,显影,显影液灵敏度差,曝光时间过短。
1 加大上样量,1.5的胶最多可以上70UL以上。2 蛋白分子量多少,20KDa以下很有可能跑丢,溴酚蓝没跑完就去转膜把。3 膜做完不要扔,用丽春红染一下看看有没有蛋白存在,同样,上样可以上两块胶,一块考马斯亮蓝染色,一块转膜WB。4 曝光时间1min 3min 10min 15min,往上加。5 看下抗体说明书,抗体是否适合做WB6 二抗浓度是否合适,封闭液BSA和牛奶都尝试过么。如果以上都没问题,估计是一抗是假货。。。。。
没有条带原因很多,以下是我目前想到的:第一,你的目的蛋白分子量多少?如果分子量大的话可以适当延长转膜时间或者尝试转膜液中加入SDS。如果分子量小考虑是否转膜过度,目的蛋白穿透膜了。第二,你的目的蛋白位置是否找到,会不会被你减掉,以前是否有成功的,位于何处,marker是否一样,可尝试条带范围宽一些。第三,一抗是否适合做WB,物种属性,二抗是否对应。第四,显影时间,表达量低的蛋白需要很长时间才能曝光。
我的是目的蛋白跑出来了。内参连在一起。一条黑黑的线。。。。
1.蛋白大小:电泳的时候要保证你的目的蛋白在分离胶上。根据蛋白大小调整胶的浓度,选择合适的marker。转膜的条件也需要视蛋白大小进行优化。2.抗体:最关键的是抗体。条件允许尽量买大公司的。抗体特异性好怎么跑都出,抗体不好再纠结细节也没有用。3.竖着铺膜试试有没有条带,可能是你电泳跑歪了,你的目的蛋白和marker根本没法比较了。4.要想跑出一条直线的效果,建议事先把蛋白浓度稀释成相近的,再等质量上样。