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蛋白质的表达、分离、纯化实验

标签: 蛋白质 表达 分离 纯化

蛋白质表达、分离、纯化可以:(1)探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理;(2)供作结构与功能的研究;(3)作为催化剂、营养剂等。

详细
实验方法
  • 原核表达法
实验方法原理

携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在 37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

一、试剂准备
 

1.  LB液体培养基:Trytone 10 g, yeast extract 5 g,NaCl 10 g,用蒸馏水配至1000 mL。
 

2.  氨苄青霉素:100 mg/mL。
 

3.  上样缓冲液:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8M Urea,10 mM  2-ME,pH8.0。
 

4.  Washing Buffer:100 mM NaH2PO4,10 mM Tris,8 M Urea,pH6.3。
 

5.   Elution Buffer:100 mM NaH2PO4,10 mMTris,8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0。
 

6.   IPTG:100mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷):2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤,-20℃保存。



二、获得目的基因
 
1.  通过PCR方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),PCR循环获得所需基因片段。
 
2.  通过RT-PCR方法:用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA,以mRNA为模板,逆转录形成cDNA第一链,以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
 
三、构建重组表达载体
 
1.  载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
 
2.  PCR产物双酶切后回收,在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
 
四、获得含重组表达质粒的表达菌种
 
1.  将连接产物转化大肠杆菌DH5α,根据重组载体的标志(抗Amp或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
 
2.  测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
 
3.  以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
 
五、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导

1.   接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5 mL LB液体培养基中(含100 ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。
 

2.  按1∶50或1:100的比例稀释过夜菌,一般转接1 mL过夜培养物于100 mL(含100 ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8(最好0.6,大约需3 h)。取10 ul 样品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.   对照组不加诱导剂,实验组加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l,37℃继续培养1-3h。
 

4.  12 000 rpm 离心10 min,弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。
 

六、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化
 

1.  NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1 mL NTA介质,并分别用8 mL 去离子水,8 mL上样缓冲液洗涤。
 

2.  重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5 mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60 min,4℃ 12000 rpm 离心 30 min,将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10 ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。
 

3.  上清样品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。
 

4.  洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01分步收集洗脱液,约3-4 h,取10 ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。
 

5.  洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10 ul样品用于SDS-PAGE 分析。
 

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注意事项
1.  选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。
 
2.  融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时,对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。

3.  菌液OD值要小于1,否则细胞太浓太老,不易破碎,且质粒易丢失。

4.  诱导时间最好做一个梯度,不同蛋白诱导时间需摸索。

5.  诱导温度适当摸索:25、30℃。

6.  IPTG浓度:一般在1 mM 以内,可适当摸索。

7.  超声条件可视实际情况改变,只要使菌体裂解充分即可,即菌液清亮不粘稠。
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其他
一、原核表达

1.  原核表达简介

将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。

2.  大肠杆菌用于表达重组蛋白的特点
 
(1)易于生长和控制;

(2)用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵;

(3)有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择;

(4)在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
 
3.  原核表达载体

通常为质粒,典型的表达载体应具有以下几种元件:
 
(1)选择标志的编码序列;
 
(2)可控转录的启动子;
 
(3)转录调控序列(转录终止子,核糖体结合位点);
 
(4)一个多限制酶切位点接头;
 
(5)宿主体内自主复制的序列。
 
4.  原核表达一般程序
 
获得目的基因-准备表达载体-将目的基因插入表达载体中(测序验证)-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析-扩增、纯化、进一步检测
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最新实验心得
(共8个心得)
  • xiaxuehua

    xiaxuehua: 蛋白质分离纯化中透析的终点判断

    透析是常见的蛋白质纯化手段,结合个人的实战经验,谈一点心得体会。

    发表于2009-07-28 21:03

  • chromatography

    chromatography: 蛋白酶切割后,目的蛋白失活

    既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性,同时保护你的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG 5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。

    发表于2004-05-21 16:34

  • dongwp

    dongwp: 简述成人胰腺消化、胰岛分离方法:

    简述成人胰腺消化、胰岛分离方法: 尸体胰腺原位灌洗后置UW液中,4℃保存运输。到实验室后在4℃ Euro-Collins液中清除非胰组织,从胰管内插入穿刺针,丝线缝扎后用注射器灌注Liberase酶溶液(1.5 mg/ml)。胰腺充分膨胀后将胰腺切片,置消化罐中并放入数颗玻璃珠,加500μm孔径的不锈钢丝网,旋紧罐盖。开启蠕动泵将剩余的Liberase酶溶液泵入罐内,控制罐内温度37℃,手动振摇消化罐循环消化,于10分钟后开始取样镜检,待大部分胰岛分离后用冷的含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液降温稀释终止消化。收集消化物用10% FBS 1640离心洗涤,将消化物混悬于150 ml UW液中,4℃冰浴30分钟。

    发表于2005-10-11 14:34

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实验问答
(共19个问题)
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更多 谁做这个实验?
  • 科研abby

    科研abby

    2个月前 觉得很难

    蛋白表达新手,学习学习

  • 百鼎象院

    百鼎象院

    3个月前 觉得很难

    原核表达之后的纯化过程需要考虑缓冲液pH值

  • chenxiaomo

    chenxiaomo

    3个月前 觉得简单

    看起来好复杂

  • 梦昕晨阳

    梦昕晨阳

    3个月前 觉得难

    如果构建重组质粒很好的话,且在种子液传代过程中不丢失、不变异,这样基本可以保证蛋白能被诱导表达出了。但是,质粒若遇到甲基化或其他影响,目的基因虽没有丢失,但却不能被诱导表达出来,这样就麻烦了!

  • 地下手术室

    地下手术室

    3个月前 觉得很简单

    才开始 有难度

  • hellosanney13

    hellosanney13

    3个月前 觉得难

    有点麻烦,容易忽略细节

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12345很简单

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