最近在PCR实验当中利用p-EASY E1载体与目的基因相连后导入trans T1感受态细胞中,然后再Amp平板上培养过夜,挑单菌落进行菌落PCR检验,然后琼脂糖凝胶电泳,但一直没有结果,条带跑不出来,只能看出引物二聚体。另外一个菌体在诱导时一直诱不出,SDS-PAGE电泳的条带与未诱导之前没有改变,不知道哪里出了问题,希望各位大神帮忙给点建议
这里的问题很多:1、连接后有没有跑过条带,是不是已经连上了?2、如果连接产物,跑电泳有条带,再转化后没有条带,说明转化有问题,培养时间多长?Amp抗性筛选,容易出现卫星菌落,严格控制时间在12-16h,尽量多挑几个菌落PCR。3、诱导不出,是很正常的,需要摸索最佳诱导条件,可以参考文献报道的诱导条件,然后摸索。比如改进诱导剂浓度,温度梯度,诱导时间等。
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