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PCR扩增产物的克隆

标签: PCR 扩增 克隆

PCR扩增产物的克隆可以:(1)获得目的DNA片段;(2)用于原核表达的研究;(3)广泛应用于分子生物学相关研究。

详细
实验方法
  • 平端连接法
  • TA克隆法
实验方法原理
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头;PCR产物纯化后,可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min(利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性)。

如果要求不高,PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶,这两种酶有5’→3’校对能力,扩增出来的PCR产物已经是平头,可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下,即使使用很高单位的连接酶,或在反应体系中加入PEG 8000,也只能很有限地提高效率。

通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低。因为Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。

这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高,在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。

对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物。
 
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、PCR反应
 
1.  依次混匀下列试剂
 
(1)H2O:35 μl
 
(2)10×PCR反应缓冲液:5 μl
 
(3)25 mmol/L MgCl2:4 μl
 
(4) 4种dNTP:4 μl
 
(5)上游引物(引物1):0.5 μl
 
(6)下游引物(引物2):0.5 μl
 
(7)模板DNA(约1 ng):0.5 μl
 
(8)混匀后离心5秒。
 
2.  将混合物在94℃下加热5分钟后冰冷,迅速离心数秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶(0.5 μl约2.5 U),混匀后稍离心,加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上。
 
3.  用94℃变性1分钟,45℃退火1分钟, 72℃延伸2分钟, 循环35轮,进行PCR。最后一轮循环结束后, 于72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。
 
二、电泳
 
取10 μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。
 
三、PCR产物的纯化
 
扩增的PCR产物如利用T-Vector进行克隆,可直接使用,如用平未端或粘性未端连接,往往需要将产物纯化。
 
1.  酚/氯仿法
 
(1)取反应产物加100 μl TE。
 
(2)加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000 rpm离心15秒,用移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。
 
(3)再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。
 
(4)在水相中加300 μl 95%乙醇,置-20℃下30 min沉淀。
 
(5)在小离心机上10000 rpm离心10 min,吸净上清液。加入1 ml 70%乙醇,稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7 ml ddH2O 中,待用。

2.  Wizard PCR DNA纯化系统
 
Wizard PCR DNA纯化系统可以快速、有效、可靠地提取PCR扩增液中的DNA,提纯后的DNA可用于测序、标记、克隆等。 该系统中含有的试剂和柱子可供50次PCR产物的纯化,试剂包括:50 ml Wizard PCR DNA纯化树脂、5 ml 直接提取缓冲液、50支 Wizard微型柱。
 
(1)吸取PCR反应液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
 
(2)加100 ml直接提取缓冲液,涡旋混匀。
 
(3)加1 ml PCR DNA纯化树脂,1分钟内涡旋混合3次。
 
(4)取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒与Wizard微型柱连接,用移液枪将上述混合液加入注射筒中,并用注塞轻推,使混合物进入微型柱。
 
(5)将注射器与微型柱分开,取出注塞, 再将注射筒与微型柱相连,加入2 ml 80%异丙醇,对微型柱进行清洗。
 
(6)取出微型柱置于eppendorf管中,12 000 g离心20秒,以除去微型柱中的洗液。
 
(7)将微型柱放在一个新eppendorf管中,加50 μl TE或水,静止1分钟后,12 000 g离心20秒。
 
(8)丢弃微型柱,eppendorf管中的溶液即为纯化DNA,存放于4℃或-20℃。
 
四、载体加dT尾
 
1.  将1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
 
2.  在小管中按上述PCR反应,加入各种混合物,除将4 μl 4种dNTP改为4 μl 25 mM dTTP。
 
3.  加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加热2 h。
 
4.  按前面三中所述,用酚:氯仿:异戊醇抽提二次。
 
5.  加入2倍体积 95%乙醇,在-20℃下沉淀1 h。
 
6、离心,用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于10ml ddH2O中。
 
五、PCR产物与载体粘末端连接
 
1.  在7 ml PCR产物中加1 ml带dT尾的pUC质粒。
 
2.  加1 ml T4DNA连接酶,1 ml 10×连接缓中液,混匀,16℃连接过夜。
 
3.  取5 ml连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
 
六、PCR产物3'突出端切平及平末端连接
 
1.  在50 ml的PCR产物中,直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混匀。
 
2.  37℃反应10分钟后,70℃灭活10分钟。
 
3.  用酚:氯仿抽提2次。
 
4.  乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后,真空抽干,溶于7 ml ddH2O中。
 
5.  质粒用Smal 切开后,70℃ 15分钟灭活酶,取1 ml (约0.1 mg)加入上述PCR产物中。加T4 DNA连接酶1 ml ,连接缓冲液1 ml 。
 
6.  取5 ml 连接产物转化感受态细胞并筛选重组子。
 
 
 
 
 
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注意事项
1.  PCR反应液可直接用于连接,但最好对PCR产物纯化后进行连接,既能去掉dNTP与ATP竞争连接酶又能浓缩PCR产物。

2.  PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。
 
3.  吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。
 
4.  加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。
 
5.  应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。
 
6.  纯化树脂在使用前必须充分混匀。
 
7.  PCR产物中矿物油应尽量吸去,否则会影响提取DNA的 产量。
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其他
一、 PCR反应中的主要成份

1.  引物
 
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:

(1) 引物长度约为16-30 bp, 太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。

(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm=4(G+C)+2(A+T)。

(3)四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。

(5)在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。

(6)两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

(7)引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。

(9)简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
 
 
(10)一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0 μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
 
X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
 
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。
 
2.  4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)

(1)dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。

(2)dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200 μmol/L。

(3)理论上4 种 dNTP各20 μmol/L,足以在100 μl反应中合成2.6 μg的DNA。当dNTP终浓度大于50 mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
 
3.  Mg2+

(1)Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。

(2)通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2 mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5 mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

(3)在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
 
4.  模板

(1)PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。

(2)就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少。

(3)灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。

(4)模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
 
5.  Taq DNA聚合酶

一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min,95℃ 40 min, 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。

Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30 min,掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。

所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低。

反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有:

(1)PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。

(2)加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+

(3) 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
 
6.  反应缓冲液

(1)反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。

(2)反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。

(3)各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
 
 
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实验方法原理 TA克隆 系统由Invitrogen公司(San Diego,CA)发展而来的商业性试剂盒,它用于PCR 产物的克隆 和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR 产物的3’末端加上一个非模板依赖的A,而T载体是一种带有3’T突出端的载体,在连接酶作用下,可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆 位点(MCS)中。

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5’除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
 
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与pGEM-T Easy Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
 
1.  取大肠杆菌JM109保存液50 μl,接种于4 ml LB(或SOB)液体培养基中,37℃,300 rpm振荡培养过夜,第二天取50 μl 转接到新的4 ml LB(或SOB)液体培养基中扩大培养3 h至OD600=0.35~0.4,在无菌操作台上取1 ml菌液于1.5 ml离心管中,冰浴10 min。
 
2.   4℃,5 000 rpm离心2 min,去上清液。
 
3.  加入750 μl预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体,冰浴30 min。
 
4.   4℃,5 000 rpm离心2 min,弃上清液。
 
5.  加入100 μl 冰冷的0.1 M CaCl2轻轻重悬菌体,冰浴2 h后,4℃保存备用。
 
 
1.  将含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃预热。
 
2.   于100 μl感受态细胞中加入10 μl连接产物,冰浴30 min。
 
3.  将离心管转入42℃水浴,热冲击90秒,然后不要摇动离心管,迅速将其放在冰上2 min。
 
4.  在离心管中加入SOC培养基300 μl,枪头混匀,37℃、150 rpm温和摇振60 min。
 
5.  将200 μl 转化菌液均匀地涂布于含50 mg/ml Amp、20 mg/ml X-gal、200 mg/ml IPTG 的LB平板上,37℃倒置培养过夜,挑选白色菌落进行鉴定。
 
三、重组质粒的鉴定
 
方案一: 菌落PCR
 
(1) 制备PCR混合液。
 
(2) 用经灭菌的10 μl枪头(不用牙签)挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
 
(3) 盖上离心管得盖子,在沸水上温育10 min。
 
(4) 将步骤 ⑶ 的样品冷却至室温,离心数秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25 ul。
 
(5) 按以下条件进行PCR反应:94℃预变性3 min;然后进行30个循环反应,其温度循环条件为:94℃变性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min。
 
(6) 取5 μl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
 
方案二: 质粒PCR
 
1.  碱裂解法少量制备质粒DNA
 
(1)用离心管收集4 ml在LB培养基(含Amp)中培养过夜的菌液,14 000 rpm离心30秒,弃尽上清。
 
(2)用250 μl已加入RNase A1的Buffer S1充分悬浮细菌沉淀。
 
(3)加入250 μl Buffer S2,温和但充分地上下翻转混合4-6次,此步骤不宜超过5 min。*Buffer S2使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶菌效率。
 
(4)加入400 μl Buffer S3,温和地上下翻转8-10次,室温静置2 min,14 000 rpm离心10 min。
 
*若离心后凝结块未沉淀到离心管底部,应再上下翻转数次,12000g离心3min。
 
(5)将DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,将步⑷中的混合液移入DNA-prep Tube中,5 500 rpm离心1 min。
 
(6) 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入500 μl Buffer W1,5500 rpm离心1 min。
 
(7)弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2,5 500 rpm离心1 min,以同样的方法再用700 μl已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。
 
(8) 弃滤液,将DNA-prep Tube置回到原2 ml Microfuge Tube中,14 000 rpm离心1 min。
 
(9)连滤液一并弃掉收集管,将DNA-prep Tube 置于一新的1.5 ml 离心管中,在silica 膜中央加入25-30 μl Eluent或去离子水。
 
(10)室温静置2 min,14 000 rpm离心1 min洗脱DNA。
 
(11) 取5 μL样品,1%琼脂糖凝胶电泳初步筛选重组转化子。
 
2.  抽提纯化质粒DNA酚、氯仿抽提可以去除碱裂解法制备的质粒DNA中残留的蛋白质。
 
(1) 加TE稀释质粒DNA溶液至300 μL。
 
(2)加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),震荡混匀,静置3 min。
 
(3)14 000 rpm 离心5 min,吸上清液,加等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),混匀,静置3 min。
 
(4) 14 000 rpm离心5 min,吸上清液,加等体积的氯仿:异戊醇(24:1),混匀,静置3 min。
 
(5) 14 000rpm离心5 min,吸上清液,加2.5倍体积预冷的无水乙醇,混匀后-20℃放置15 min,沉淀质粒DNA。
 
(6) 14 000rpm离心13 min,弃上清液,沉淀加入200 μL 70%乙醇洗涤一次,室温干燥,用20μL去离子双蒸水溶解质粒DNA沉淀,-20℃保存待用。
 
(7) 取5 μl样品,1%琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。
 
3.  质粒PCR
 
(1) PCR反应体系如下:
 
(2)PCR 扩增反应条件:94℃预变性3 min;然后进行30 个循环反应,其温度循环条件为:
 
94℃变性1 min,57℃退火1 min,72 ℃延伸1 min;循环结束后72℃再延伸5 min。
 
(3) 取5μl PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,方法与试验二相同。
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注意事项
1.  要获得目的基因的TA克隆 ,PCR 产物的特异性要好。
 
2.  PCR 产物在TA克隆 前要通过纯化。
 
3.  在PCR 产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
 
4.   制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作,同时注意近火无菌操作,防止感受态细胞受杂菌污染。
 
5.  42℃热处理时很关键,转移速度要快,且温度要准确。
 
6.   菌液涂皿操作时,应避免反复来回涂布,因为感受态细菌的细胞壁有了变化,过多的机械挤压涂布会使细胞破裂,影响转化率。

8.  Ligation Solution I 请于冰中融解。
 
9.  在进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为:1: 2 ~ 10。在本制品中, pMD18-T Vector1 ml (50 ng) 的摩尔数约为0.03 pmol,Control Insert DNA 1ml (50 ng) 的摩尔数约为0.15 pmol。
 
10.  克隆时使用的Insert DNA片段 (PCR 产物) 尽量进行切胶回收纯化,PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。
 
11.  按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 ml。当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。
 
12.   连接反应请在16℃下进行,温度升高 (>26℃) 较难形成环状DNA。
 
13.   连接效率偏低时,可适当延长连接时间至数小时。
 
14.   感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞,如:JM109,DH5a等。
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其他
一、常见问题

1.  怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?
 
(1) 纯化PCR产物,切胶回收的PCR片段最好。
 
(2)除去残存的引物等杂质。
 
(3)DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)小于短片段DNA,在使用大片段DNA的连接液进行转化时,建议采用电转化方法。
 
 
2.  PCR产物难以插入载体,为什么?
 
(1)确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆;PCR产物保存时间不要过长,长时间保存的PCR产物会脱去末端的"A"碱基。
 
(2)PCR产物中短片段杂质DNA太多,这时应切胶回收纯化DNA片段,回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。
 
(3)确认感受态细胞的转化效率,使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。
 
(4)确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低,多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。
 
(5)确认抗生素的浓度是否过大。
 
(6)最好使用新配制的平板培养基。
 
3.  转化后的菌落全为蓝色 (或淡蓝色),为什么?
 
插入的PCR片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的读框时,平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色。
 
4.  插入的PCR产物进行测序时,可使用何种引物?
 
本制品的载体来源于pUC18载体。因此,用于pUC18载体测序的引物都可以使用。
 
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最新实验心得
(共6个心得)
  • coven

    coven: PCR扩增产物于引物区会发生移码突变吗?

    设计引物扩增目的片断,上游引物序列为:GGCCCAGCCGGCC ATGGTGTTAAGTCTTCTGTA(空格前为酶切位点),扩增产物与T载体连,测序正确,但峰形不好,即在GTT之间有个大C峰,之后酶切与另一载体连接,测序总是在ATGGTG后多了一个G,解答到期是引物的问题,导致PCR扩增时发生突变,还是引物合成的问题。

    发表于2007-03-24 00:41

  • zcldf001

    zcldf001: PCR扩增产物不理想

    针对PCR扩增产物不理想,分别从引物设计、模板量、DNA提取的质量、起始样品、电泳上样量5个方面进行分析。

    发表于2012-05-16 23:04

  • sunnyboy6345

    sunnyboy6345: 引物设计几个注意事项

    引物设计要注意的几个地方:发夹结构,反向配对,GC含量(40-60%),退火温度(45-65度),引物长度(18-27bp),3' 端最好是C、G(提高结合度),引物在序列中的错配位点。

    发表于2004-07-26 22:37

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