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逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

标签: 逆转录 RT-PCR 聚合酶链反应

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)可以:(1)分析基因的转录产物;(2)获取目的基因;(3)合成cDNA探针;(4)构建RNA高效转录系统。

详细
实验方法
  • RT-PCR技术
实验方法原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

一、总RNA的提取

见“总RNA的提取”相关内容。
 

二、cDNA第一链的合成

目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
 

1. 在0.5 ml微量离心管中,加入总RNA 1-5 μg,补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo(dT)12-18 1 μl,轻轻混匀、离心;
 

2.70℃加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min;
 

3. 取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2 μl;上游引物(10 pM) 2 μl;下游引物(10 pM) 2 μl;dNTP(2mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl) 1 μl。轻轻混匀,离心。42℃孵育2-5 min;

4.加入SuperscriptⅡ1 μl ,在42℃水浴中孵育50 min;
 

5. 于70℃加热15 min以终止反应;
 

6.将管插入冰中,加入RNase H 1 μl ,37℃孵育20 min,降解残留的RNA。-20℃保存备用。
 

三、PCR

1.取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl;
 

2.加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心;
 

3.设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照;
 

4.电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果;
 

5.密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。
 

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注意事项

1.在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;
 

2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照;
 

3.内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差;
 

4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定;
 

5. 防止DNA的污染: 采用DNA酶处理RNA; 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。

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其他

1.反转录酶的选择
 

(1) Money 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃;
 

(2)禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃;
 

(3)Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶:在Mn2+存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构;
 

(4)MMLV反转录酶的RNase H-突变体:商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
 

2.合成cDNA引物的选择
 

(1) 随机六聚体引物:当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
 

(2) Oligo(dT):是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。

 

(3)特异性引物:最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。

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  • dxy_4y21ap9q

    dxy_4y21ap9q

    3个月前 觉得难

    非常难得实验

  • 郭晓婧

    郭晓婧

    3个月前 觉得很难

    主要就是小心谨慎加液量少需要技巧

  • 提灯女神2012

    提灯女神2012

    3个月前 觉得很难

    谢谢

  • 火車少女

    火車少女

    3个月前 觉得很难

    很难,没有人教,完全摸不到头脑.

  • Minda123456

    Minda123456

    3个月前 觉得很难

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