实验方法原理 | 采用特殊的细胞裂解和蛋白去除液(包括蛋白酶K 裂解)从抗凝全血中得到基因组DNA。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
1. 说明书,耗材:96孔深孔板(1.6 ml),96圆孔板,96孔DNA制备板,96圆孔硅胶片,BF-400膜。
2. Proteinase K:冻干的蛋白酶K 可室温贮存6 个月,长时间保存请置于4℃;溶解后,在2-8℃可贮存2 个月,长时间保存请勿置于室温中。
3. Buffer PK :蛋白酶K 溶解液,室温密闭贮存。
4. Buffer BL :细胞裂解液,室温密闭贮存。
5. Buffer W1B concentrate :洗涤液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
6. Buffer W2 concentrate :去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
7. 10xBuffer W2(12x96 试剂盒):用于配制Buffer W2 。
8. Eluent B:7.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,0.3 mM EDTA ,室温密闭贮存。
二、实验准备
1. 第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 和Buffer W1B concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
2. Buffer W2(12x96 试剂盒)配制:在提供的500 ml 空瓶中加入15 ml 10xBuffer W2,135 ml 去离子水和350 ml 乙醇,可用100%无水乙醇或95%乙醇。
3. 根据瓶上标签将蛋白酶K 溶解于Buffer PK 中,请勿旋涡振荡。
4. 准备70℃温浴。
5. 使用前检查Buffer BL 是否有沉淀析出,若出现沉淀,请于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用。
三、操作步骤
1. 向96 圆孔板的每孔中加入20 ul 蛋白酶K。
2. 加200 ul 抗凝全血到96 圆孔板中。
* 若全血样品体积少于200 ul,用PBS 补充到200 ul。
* 若样品为鸟类血,样品用量须低于10 ul。
* 若需得到RNA-free 的基因组DNA,在步骤3 加入Buffer BL 前加入DNase-free 的RNase A(20 mg/ ml) 。
3. 加200 ul Buffer BL ,注意不要打湿每孔的边缘,用96 圆孔硅胶片密封各孔。
4. 用力混合30 s。
5. 3000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3000rpm后即停止。
6. 在培养箱或烘箱中70℃温浴至少10 min。
7. 3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到96圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000rpm后即停止。
8. 取下96 圆孔硅胶片,每孔加入200 ul 乙醇(96-100%)。
9. 用96 圆孔硅胶片密封各孔,用力混匀混合15 s。3 000 rpm 简短离心使96 圆孔硅胶片上的溶液到圆孔板内。启动离心机,当速度达到3 000 rpm 后即停止。
10. 将96 孔DNA 板放到一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板。取下圆孔板上的96 圆孔硅胶片,将每孔中的溶液转移至96 孔DNA 板 中,6 000 rpm 离心4 min。
11. 丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入500 ul Buffer W1B,用一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
* 确认在Buffer W1B concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
12. 丢弃96 孔1.6 ml 深孔板的滤液,将96 孔DNA 板放回到96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入850 ul Buffer W2,用另一新 的BF-400膜密封96孔DNA板,6 000 rpm 离心4 min。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
13. 弃滤液,将96孔DNA板放回到96孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入400 ul Buffer W2, 用另一新的BF-400 膜密封96 孔DNA 板,6 000 rpm 离心4 min。
14. 将96孔DNA板放在一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,用BF-400膜密封96孔DNA板,6 000 rpm离心15 min。
15. 将96孔DNA板放在另一洁净的96 孔1.6 ml 深孔板上,每孔加入100-200 ul Eluent B 或去离子水,室温静置2 min,用另一新的BF-400膜密封96 孔DNA板,6 000 rpm 离心4min洗脱得到DNA。
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注意事项 |
1. Buffer BL 和Buffer W1B 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水和生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。
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实验方法原理 | 本试剂盒采用独特的两相分离技术,结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DN的目的。适合从5 ml 的抗凝人或哺乳动物全血,或500 ul 抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至250 ug 的基因组DNA。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
1. 说明书,耗材:DNA 制备管、中量滤器、连接管。
2. Buffer VL:细胞和病毒裂解液,室温密闭贮存。
3. Buffer G-B:蛋白沉淀液,室温密闭贮存。
4. Buffer DV-A:Buffer DV 的制备液。请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制,室温密闭贮存。
5. Buffer DV:相分离液,室温密闭贮存。
6. Buffer BV:DNA 结合液,室温密闭贮存。
7. Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
8. Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
9. Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
二、实验准备
1. 第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。
3. 制备Buffer DV:取4 ml Buffer DV-A 250 ml 异丙醇,150 ml 异丁醇,加入提供的500 ml 试剂瓶中,混合均匀。
4. 4℃预冷Buffer DV。
三、实验步骤
【DNA 释放 】
1. 将5 ml 抗凝全血置于一50 ml 离心管中,若全血样本体积不足5 ml,用PBS 补充至5 ml。
2. 加入10 ml Buffer VL,盖紧离心管帽,旋涡振荡1 min。
3. 加入10 ml Buffer G-B,再次盖紧离心管帽,立刻上下混匀。
【两相分离去除蛋白和其它杂质】
4. 加入20 ml Buffer DV(4℃预冷),用力混合均匀。≥5 000xg 离心5 min。
* 请在实验前按照第一页准备Buffer DV。
5. 尽可能丢弃上相,保留相间沉淀和下相。加入20 ml 4℃预冷Buffer DV,用力混合,≥5 000xg离心5min。
【基因组DNA 的纯化】
6. 丢弃上相,将下相转移至中量滤器中(滤器置于另一50 ml 离心管中),将活塞插入注射器,缓慢推动活塞,收集50 ml 离心管中的滤液。
* 上相必须完全弃尽。
7. 弃滤器,在滤液中加入10 ml Buffer BV,混合均匀。
8. 将DNA 大量制备管插到负压装置的插口上,将步骤7 的混合液移到制备管中,开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱。
9. 待步骤8 管中液体都吸尽后,加入15 ml Buffer W1,吸尽管中液体,保持负压。
10. 加入20 ml 已加入乙醇的Buffer W2,吸尽管中液体,关闭负压装置。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
11. 将大量制备管从负压装置转移至另一洁净的50 ml 离心管中,≥6 000xg 离心5 min。
12. 将大量制备管插回到负压装置的插口上,保持负压5 min,吸尽残存的Buffer W2。
13. 将大量制备管置于另一洁净的50 ml 离心管中,在silica 膜中央加1.5 ml Eluent 或去离子水,室温静置5 min,≥6 000xg 离心5 min 洗脱DNA。
* 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
14. 可选步骤:同样方法,在silica 膜中央加0.75 ml Eluent 或去离子水,室温静置1 min,≥6 000xg 离心5 min 洗脱DNA。
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注意事项 |
1. 下列操作步骤适合从5 ml 的抗凝人或哺乳动物全血,或500 ul 抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至250ug 的基因组DNA。
2. Buffer VL,Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水和生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。
3. 在按照此说明书操作前,请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作,按照正确方法处理体液和感染体。
4. 操作时严格按操作步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,并高压灭菌。
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实验方法原理 | 本试剂盒采用独特的两相分离技术,结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到纯化基因组DNA的目的。适合从3 ml的抗凝人或哺乳动物全血获得100 ug的基因组DNA,抗凝鸟类或两栖动物全血中获得多至120 ug的基因组DNA。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
说明书,耗材:中量制备管、中量滤器、连接管、塑料扳手、中量管盖。
Buffer VL:细胞和病毒裂解液,室温密闭贮存。
Buffer G-B:蛋白沉淀液,室温密闭贮存。
Buffer DV-A:Buffer DV 的制备液,请参照实验准备Buffer DV 的配制方法配制,室温密闭贮存。
Buffer DV:相分离液,室温密闭贮存。
Buffer BV:DNA 结合液,室温密闭贮存。
Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
二、实验准备
1. 第一次使用时,在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
2. 准备无核酸和核酸酶污染的Tip 头、离心管。
3. 制备Buffer DV:取2 ml Buffer DV-A 125 ml 异丙醇,75 ml 异丁醇,加入提供的250 ml 试剂瓶中,混合均匀。
4. 4℃预冷Buffer DV。
三、操作步骤
【DNA 释放 】
1. 将3 ml 抗凝全血加入一50 ml 离心管中,若全血样本体积不足3 ml,用PBS 补充至3 ml。
2. 加入6 ml Buffer VL,盖紧离心管帽,旋涡振荡1 min。
3. 加入6 ml Buffer G-B,再次盖紧离心管帽,立刻上下混匀。
【两相分离去除蛋白和其它杂质】
4. 加入12 ml Buffer DV(4℃预冷),用力混合均匀。≥5 000xg 离心5 min。
* 请在实验前按实验准备中提供的方法准备Buffer DV。
5. 尽可能吸尽蓝色上相,保留相间沉淀和下相。加入12 ml,4℃预冷Buffer DV,用力混合,≥5 000xg 离心5 min。
【基因组DNA 的纯化】
6. 丢弃上相,将下相转移至中量滤器中(滤器置于另一50 ml 离心管中),将活塞插入注射器,缓慢推动活塞,收集50 ml 离心管中的滤液。
* 上相必须完全弃尽。
* 如在转移过程中下相没有任何界面沉淀,步骤6 可以省略。
7. 弃滤器,在滤液中加入6 ml Buffer BV,混合均匀。
8. 将连结管插到负压装置的插口上,再将DNA 中量制备管插到连结管上。将步骤7 的混合液移到制备管中,开启并调节负压装置至-20-30 英寸汞柱,吸尽管中液体。
9. 保持负压,加入8 ml Buffer W1,吸尽管中液体。
10. 保持负压,加入9 ml 已加入乙醇的Buffer W2,吸尽管中液体。
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
11. 用塑料扳手将中量制备管中的DNA 结合部分从负压装置转移至另一洁净的1.5 ml 离心管中,加入0.3 ml Buffer W2,盖上中量制备管盖后,12 000xg 离心2 min。
12. 将DNA 结合部分置于另一洁净的1.5 ml 离心管中,在silica 膜中央加0.5 ml Eluent 或去离子水,盖上中量制备管盖后,室温静置2 min,12 000xg 离心1 min 洗脱DNA。
* 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
13. 可选步骤:同样方法,在silica 膜中央加0.25 ml Eluent 或去离子水,盖上中量制备管盖后,室温静置1 min,12 000xg 离心1 min 洗脱DNA。
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注意事项 | 1. Buffer VL,Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水和生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。
2. 在按照此说明书操作前,请确保已做好足够的对血传播病毒的防护工作,按照正确方法处理体液和感染源。
3. 操作时严格按操作步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,并高压灭菌。
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