丁香通

（3）注射针内DNA的装载

把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中，溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端，距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。

（4）受精卵的显微注射

受精卵的显微注射过程相对简单，制作大量样品过程中，为保证显微注射量的一致性，必须通过大量反复有效的练习才可以成功。

1）  置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。

2）  调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。

3）  挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。

4）  如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。

5）  移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。

6）  对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。

7）  维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。

8）  保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：

①  注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。

②  一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。

③  注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。

④  若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。

9）  用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。

5．受精卵的输卵管转移

（1）受精卵的输卵管注射

1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。

2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。

4）  用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。

5）  手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。

6）  轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。

7）  用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。

8）  一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。

9）  在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。

10）  移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。

10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。

11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。

12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。

（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。

处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。

手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。

（四）转基因小鼠的鉴定

产出的鼠仔中，属转基因小鼠者，约占全部仔小鼠的20％-30％。因此，对转基因小鼠必须进行鉴定筛选。

1．  转基因整合检测

鉴定转基因小鼠最简单的方法是从小鼠尾尖提取基因组DNA，检测其基因型。检测方法包括PCR和Shouthern 杂交。

（1）  基因组DNA的提取：

1）  将离乳期小鼠（>4周龄）麻醉标记。

2）  用一只手抓住小鼠，另一只手持消毒剪剪下约1cm的鼠尾。

3）  将剪下的鼠尾放入500l消化缓冲液中（50mmol/L Tris-HCl, pH8.0; 100mmol/LEDTA; 100mmol/LNaCl; 1%SDS）, 并加入蛋白酶K使其终浓度为100 g/ml，550C下震荡孵育3~4 小时或过夜孵育。

4）  加入5 l RNA酶A，370C孵育1~2小时。

5）  DNA的分离纯化步骤参见第一章的第三节。

（2）  PCR检测： 转基因的初始筛选通常采用PCR检测技术。该技术操作简便、快速、费用低而有效，适合大量标本的分析。由于该技术特别敏感，可能产生假阳性结果。因此，在操作过程中必须特别小心，避免质粒DNA或其它标本的基因组DNA的污染。假阳性的产生对转基因小鼠的筛选工作将是致命的。PCR实验应采用双复管，甚至三复管。阳性结果最好用Southern杂交技术进一步证实。

PCR的实验操作参见第一章的第六节。

（3）  Southern blot分析：该技术虽然没有PCR技术那样敏感，且费力费时，但是避免了因污染导致假阳性结果的麻烦，可以得到目的基因整合后的基因组、整合位点数目、转基因拷贝数等的确切信息。Southern blot的实验操作参见第一章的第八节。

2．  转基因表达检测

转基因整合检测是确定目的基因是否整合到了小鼠的基因组中，同时可确定整合的位点和拷贝数，这在遗传学上是十分重要的。而转基因表达检测是确定目的基因在转基因小鼠器官组织中表达的时空分布。其检测包括RNA分析技术和蛋白质检测技术。

（1）  RNA的分离：根据实验者的需要从转基因小鼠组织或细胞中提取总RNA或mRNA。分离总RNA比较简单，且适合做基因做基因转录分析。实验操作参见第一章的第四节。

（2）  Northern 印迹分析：该技术用于定性检测转基因动物组织或细胞中转基因转录的相对水平。其实验操作参见第一章的第九节。

（3）  RT-PCR检测：该技术可定量或半定量检测转基因小鼠组织或细胞中转基因特异表达的mRNA，且非常敏感，Northern 印迹未能检测到的转录子，该技术亦可检测到，甚至可测出1000个细胞中的一个拷贝的转录子。其实验操作参见第三章第一、二节。

（4）  Western 印迹分析：该技术通常用于转基因小鼠组织或细胞中转基因编码蛋白的表达水平。其实验操作参见第一章第十节。

（5）  免疫组织化学分析：该法可检测转基因编码蛋白表达在转基因小鼠中的组织分布。有多种实验方法，可参看相关的免疫学检测技术书籍。

附录：特殊实验溶液的配制

1. M16溶液：

称取 0.5534 g NaCl，0.0356 g KCl，0.0162 g KH2PO4，0.0294 g MgSO4•7H2O， 0.0252 g CaCl2•2H2O，0.32 ml乳酸钠(60% 糖浆)，0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖，0.0010 g酚红，0.2106 g NaHCO3。溶于100ml超纯水，0.22m滤膜过滤除菌，分装后40C储存不超过3周，加入4 mg/mL BSA可立即使用。

2. M2 溶液：

称取0.5534 g NaCl, 0.0356 g KCl, 0.0162 g KH2PO4, 0.0294 g MgSO4•7H2O,

0.0252 g CaCl2•2H2O,0.32 ml 乳酸钠(60% 糖浆), 0.0036 g丙酮酸钠, 0.1000 g D-葡萄糖,0.0010g酚红 0.0337g NaHCO3, 0.5000g HEPES。定容于100ml超纯水，0.22m 滤膜过滤除菌，分装后40C储存不超过3周。M2用于孵箱外卵的操作，用HEPES调节pH,加入4 mg/m BSA可立即使用。

3.工作液：无丙酮酸钠的高糖（4500 mg/mL）DMEM。具体配制见说明书

4.注射缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, 调节pH 为7.5.