丁香通

ygtong:呵呵，我来总结一下吧。

关于凋亡的检测，方法很多，根据总结，大概由以下几大类：

1、凋亡的形态学观察。

具体步骤很简单：将细胞用药物处理后，用染核的荧光染料染核。直接在荧光显微镜下观察拍照。

2、DNA ladder观察

具体步骤简单：将细胞收集裂解，跑琼脂糖电泳，如果有ladder出现，则有凋亡。

3、用流式细胞仪。

具体步骤简单：将细胞收集理解，用荧光染料染核。

4、用tunel标记

5、anexin V检测早期凋亡

这些方法是按照不同的原理来检测凋亡的。

用荧光显微镜观察主要就是看细胞凋亡小体的出现，而细胞用不用固定主要看你用何种荧光染料（染核）？如果染料可以通过细胞膜，则固定不固定都无所谓。PI是典型的不能透过细胞膜的染料，因此它无法染活细胞的核，如果单用PI检测凋亡，则必须固定。DAPI和hochest染料是可以透过膜的，它们可以不用固定，但平时人们习惯都固定，因为固定了细胞就不会代谢，不再发生变化，有利于长时间观察。

用单个染料检测凋亡，现在通常认为误检率较高，更重要的是，认为它无法区分死细胞产生的细胞碎片和凋亡小体。因此，现在的检测凋亡小体的凋亡试验，如果严谨一点，需要用双标来区分死细胞产生的细胞碎片和凋亡小体。

原理就是PI能染死细胞，hochest都能染，如果看到的聚缩的核能被hochest染上，而不能被pi染，那才是真正的凋亡小体。

而对于流式细胞技术来说，作为一种技术，它有很多很多很多的用途，不只是单单用于检测细胞凋亡。其实它最早好像是作为血细胞分选用的。

现在流式可以用于检测凋亡，用于活细胞分选等等，细胞可以固定可以不固定。只取决于你的试验目的。

即使在流式检测凋亡，根据检测凋亡的原理有三种方法

1、亚G1峰检测

2、tunel标记检测

3、annexin V检测早期凋亡。

在这些方法中，annexin V通常也需要联合用PI进行双标，为什么?同样是为了除去死细胞的影响。

而tunel标记它检测的是DNA断裂端，它本身试验方法就可以区别死亡和凋亡，因此就不需要预先排除死细胞了。

严格意义上来说，亚G1检测也需要双标排除死细胞。

其他

lxk0331: 我用一种质粒转染PC12细胞，观察细胞凋亡，我准备先培养皿上做hoechst33258染色，观察核碎裂，然后再消化下来做流式，不知有谁做过没？

由于做hoechst染色要用多聚甲醛固定细胞，而做流式PI染色时用的是冰预冷的70%乙醇固定的，不知道多聚甲醛对PI染色有没有影响啊？

vanilla006: 本人曾对MCF细胞染色，总体说来，多聚甲醛染色比起70％乙醇的CV值略差，只要细胞处理的好，差别不会很大不会很大影响，也可以试着两步法固定，即多聚甲醛固定半小时后，PBS洗涤后以70％的乙醇固定。

sunandsuny你的意思好像不是用它们两者做双标,我倒是觉得你先用PI染色测凋亡细胞亚二倍体峰型,再用hoechst33258染色一下而且这时不需要多聚甲醛固定了.

其实你也可以做他们的双标检测,不用固定

ze_quan: 在做凋亡的过程中遇到如下问题，请高手帮忙：

1.DNA ladder 跑出来了，但是流式用简单的PI染色看不到凋亡峰

2.流式用pi染色没有看到凋亡，DNA ladder是不是就一定跑不出来。

对此问题，我这样理解，因为PI染色是看DNA含量的，若凋亡发生在G0/G1期，则PI染色应该能够看到亚二倍体峰，若凋亡发生在S晚期，或G2/M期，则流式不一定能看出来。所以第一种情况是可能的。对第二种情况，可能是根本没发生凋亡，也可能是凋亡不在G0/G1期，所以DNA ladder能不能跑出来不一定。就是真有凋亡，DNA ladder也不一定跑的出来。

qingshi： PI染色只能看出晚期凋亡，你说的情况可能是早期凋亡，PI染色看不到，所以PI染色只是分析细胞周期的好办法，而annexin V法是目前同时检测凋亡和细胞周期的最好办法，快速，简易（10分钟）。

ze_quan: DNA ladder是晚期凋亡，PI染色的流式也是晚期凋亡，二者结果也不一定一致吗？

Fang CY: 细胞凋亡的特征性指标之一是DNA ladder,而PI染色指标为为特异性，所以，二者可能存在非相关性。另外，并非在所有情况下，DNA Ladder都能成功。

tangaifa：我做的是贴壁细胞，我用不同的药物浓度去处理细胞，但有些问题让我很为难：

我加药物后，要等合适的时间才能收集细胞做FCM，检测细胞凋亡和死亡情况。如果太早，对照和处理组没有区别，因为药物作用需要时间。如果太晚，细胞死的太多，细胞数量会达不到要求。我现在是用7天时间，中间不能换液，因为上清中的死细胞应该也要加到我最后的细胞比例中。7天处理的结果是有些有差异，有些则和对照无差异。而我的设想是所有处理组和对照组都应有差异。下次我应该延长处理时间，但中间是否应该换液？换液时的细胞上清应该收集吗？

silvia：中间应该换液，否则因营养不够导致的细胞死亡会严重影响实验结果。可以在细胞培养板中进行实验，换液前将培养板离心，使死细胞也沉在板底，轻轻吸出一半液体，补加含等量药物的新鲜培养液即可。

leonhu97：我用的是6孔板，看来换液时只有轻轻地吸去上清，而留下死细胞了。我没用过可直接离心的培养板，不知这种板能否达到10的6次方的细胞量？

silvia：不是专门用来离心的培养板，就是一般的培养板，只是需要特制的离心架子，就象离心管离心也需特定的转子一样。一般实验室都有，可以问问。

tangaifa：我现在准备这样，在药物处理的前期，可以进行换液，也都把死细胞去掉。在处理后期，当基因和药物的作用开始显现时则停止换液了。SILVIA，你认为如何？上次的结果，对照组20%的死细胞（包括凋亡和坏死细胞），处理组60%的死细胞。

qmmq：听师兄师姐说可以把心肌组织磨碎然后过滤网，再利用PI标记后，上流式检测细胞凋亡，但是我做过几次，什么都没有，而且细胞数量很少，上机测的老师说细胞碎片太多，测不出来，请教各位大侠，这种方法可行吗？

crabda：PI标记后通过DNA分析测凋亡，错检的比例比较高吧