Western Blot 现在仍然是检测和分离蛋白最常用的一种实验方法,但是要想得到较好的结果并不容易,只有找到合适的实验条件并进行优化,才能以更少的时间得到更多的结果,达到事半功倍的效果!下面是 R&D Systems 品牌为您推荐的免疫印迹优化步骤和实验涉及参考数据:
一抗浓度对实验结果的影响
抗体:Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog # AF992)
样本:人 HeLa 细胞 (Fig.1)
A:5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
B:5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.2 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
Fig.1
脱脂奶粉及 NaCl 浓度对实验结果的影响
抗体:Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)
蛋白分离:人 HeLa 细胞 (Lane 1),MCF-7 (Lane 2) 和 TF-1 (Lane 3)(Fig.2)
A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl
B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl
C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5 M NaCl
Fig.2
一抗浓度、一抗溶液中脱脂奶粉含量及印迹缓冲液中 NaCl 浓度对实验结果的影响
抗体:Human PTP1B Antibody (Catalog # AF1366)
2% 脱脂奶粉溶液中一抗浓度对实验结果的影响 (Fig.3):
A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.3 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.1 mg/mL,溶于 2% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
Fig.3
5% 脱脂奶粉溶液中一抗浓度对实验结果的影响 (Fig.4):
A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.3 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
C. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:0.1 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
Fig.4
印迹缓冲液中 NaCl 浓度对实验结果的影响 (Fig.5):
A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0.15 M NaCl
B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉,0. 5 M NaCl
Fig.5
印迹溶液中 NaCl 浓度对实验结果的影响
抗体:Human/Mouse/Rat RSK1 Antibody (Catalog# AF992)
样本:人 HeLa 细胞 (Fig.6)
A. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.15 M NaCl
B. 5% 脱脂奶粉封闭,一抗浓度:1.0 mg/mL,溶于 5% 脱脂奶粉和 0.5 M NaCl
Fig.6
我们为您推荐实验设计数据参考:
裂解缓冲液
蛋白定位 |
裂解液 |
推荐试剂盒 |
全细胞 |
NP-40 or RIPA |
全蛋白抽提试剂盒 |
细胞质(可溶蛋白) |
Tris-HCl |
胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 |
细胞质(细胞骨架 等不溶蛋白) |
Tris-Triton |
蛋白分级抽提试剂盒 |
细胞膜 |
NP-40 or RIPA |
膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 |
细胞核 |
RIPA |
核蛋白抽提试剂盒 |
线粒体 |
RIPA |
线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒 |
蛋白酶磷酸酶抑制剂
抑制剂 |
蛋白酶或磷酸酶 |
PMSF |
丝氨酸蛋白酶抑制剂,如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶 |
Leupeptin 亮肽素 |
抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶,如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B |
Aprotinin 抑肽酶 |
丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X |
Pepstatin 胃蛋白酶抑制剂 |
抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳 酶、许多微生物酸性蛋白酶 |
EDTA-Na2 |
金属蛋白酶抑制剂 |
NaF氟化钠 |
丝氨酸、苏氨酸磷酸酶 |
Na3VO4原矾酸钠 |
酪氨酸磷酸酶 |
电泳凝胶的制备
蛋白分子量 (kDa) |
凝胶浓度 (%) |
4-40 |
20 |
12-45 |
15 |
10-70 |
12.5 |
15-100 |
10 |
25-200 |
8 |
内参对照
内参名称 |
分子量大小 |
适用范围 |
Beta-actin |
43kDa |
胞浆和全细胞 |
GAPDH |
30-40kDa |
胞浆和全细胞 |
Tubulin |
55kDa |
胞浆和全细胞 |
VCDA1/Porin |
31kDa |
线粒体 |
COXIV |
16kDa |
线粒体 |
Lamin B1 |
16kDa |
细胞核(不适于去除核膜的样本) |
TBP |
38kDa |
胞浆和全细胞 |
转膜
PVDF 膜 |
NC 膜 |
尼龙膜 |
|
灵敏度和分辨率 |
高 |
高 |
高 |
背景 |
低 |
低 |
较高 |
蛋白结合能力 |
100-200μg/cm2 (适用于SDS 存在时与蛋白结合) |
80-100μg/cm2 |
大于400μg/cm2 |
机械强度 |
强 |
干的膜易脆 |
软而结实 |
溶剂抗性 |
强 |
差 |
差 |
浸润 |
100% 甲醛 |
缓冲液 |
缓冲液 |
适用染色方法 |
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 |
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 |
不能用阴离子染料 |
适用检测方法 |
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 |
显色法、化学发光、荧光、放射性 |
显色法、化学发光、放射性 |
适用范围 |
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 |
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1μm膜适用于70KDa以下蛋白 |
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用 |
价 格 |
高 |
较低 |
低 |
显色
底物 |
DAB |
4-CN |
AEC |
TMB |
稳定性 |
好 |
一般 |
避光 |
好 |
灵敏度 |
250pg |
1ng |
100pg |
|
背景 |
一般 |
低 |
高 |
高 |
终产物成像性 |
成像较难 |
容易成像 |
容易成像 |
|
颜色 |
褐色 |
介于蓝色与蓝紫色之间(可用于双染) |
棕红色 |
蓝紫色 |
毒性 |
有(疑有治癌作用) |
无 |
有 |
无 |
选择 R&D Systems 抗体的四大理由:
Purification-采用抗原亲和纯化的方式对抗体进行纯化,纯化后的抗体具有更好的特异性;
Antigens-使用重组蛋白作为制备抗体的免疫原,大大提高了抗体对抗原的特异性识别能力;
Specificity-批次间稳定性的严格控制,有效保证了 R&D Systems 目录抗体在识别抗原时的特异性;
Source-多种宿主来源,以及多种单抗或多抗的选择,为客户提供了更丰富、更贴心的选择。
上海优宁维生物科技股份有限公司
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