关键词: Western-Blotting 杂交
来源: 互联网
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1. 溶液准备:
转印缓冲液:0.025M Tris base , 0.192 M甘氨酸 , 30%甲醇
10×TBST:250mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 1.25M NaCl , 0.5%Tween20
封闭液:1×TBST , 3%脱脂奶粉
洗涤液:1×TBST
2. 实验程序:
A. 膜的准备:
将PVDF膜切成条浸在甲醇中,室温条件下在摇床上摇1min,去除甲醇后加入1×TBST备用。
B. 膜转印:
1. 细胞或组织裂解液进行SDS-PAGE电泳
2. 用夹心法电转至PVDF膜
3. 海绵和滤纸浸泡在转印缓冲液预湿润
4. 在半干转印系统中10v转印2h,封闭液室温封闭1h或者4℃过夜。
C. 抗体检测:
1. 将一抗溶解于3ml封闭液中,终浓度为4μg/ml,4℃孵育过夜。
2. 用洗涤液洗涤3次,每次5min.
3. 用封闭液来稀释二抗(HRP标记的抗兔或抗鼠),室温下培育1h.
4. 用洗涤液洗涤3次,每次5min.
5. 用化学发光底物检测。
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为什么同一批次提取蛋白跑出的条带不一致
做这个实验的时,我同一批次提取的蛋白,胶跑出的条带都不一致,这是什么原因呢?
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WB 敷牛奶需要的时间
Western Blot 实验时敷牛奶大概多久?一定要过夜吗
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WB发光结果异常
我做WB也不算是新手,自己觉得整个过程也没有什么明显的问题,可是最后发光的时候内参整个是晕开的,分子还连成了一条线,之前没出现过这种情况,所以想请大家帮忙分析下,是胶的问题,蛋白的问题,还是什么别的,谢啦!
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