PCR-SSCP原理和操作步骤
原理PCR-SSCP是1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象,其构象直接影响泳动速率,相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别,就可以产生立体构象的不同,造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带。P ...
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pcr-sscp法
PCR-SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其 ...
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荧光定量PCR详细流程和问题解析(五)
其他方法也可以采用类拟的策略,以节约成本,提高效率。反应体系的建立及优化1. SG浓度:终浓度1:5,000-1:100,000,一般为1:10,000-1:70,0002. Primer浓度:终浓度50nM-300nM固定摸板浓度的梯度实验不加摸板的对照实验(NTC)--有无非特异信号熔解曲线的分析--是否单峰建议使用HPLC纯化的引物3. MgCl2浓度降低MgCl2浓度以减少非特异性产物最低可至1.5nM同时做梯度实验和NTC对 ...
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PCR-SSCP注意的事项
SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法,为了使SSCP达到最佳效果,应注意下列事项。1. 重复性影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度。这两个条件保持不变,SSCP图谱可保持良好的重复性。一般SSCP图谱是二条单链DNA带,但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带,或者三条以上,这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象。有时三条以上 ...
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