实验方法原理 | 通过特异性阻断PI3K和mTOR,观察HepG2和Hep3B细胞株PI3K/Akt/mTOR信号通路活性及生物学行为的改变,探讨相关的分子机制。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、细胞株表达情况监测
1. 在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上,以免疫印迹方法(Western blot)检测各细胞株中PI3K(p110α亚单位)、PTEN、pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表达情况。 2. 分别用 PI3K抑制剂LY294002(50 umol/ml)和mTOR抑制剂Rapamycin(RAPA,50 nmol/ml)孵育HepG2和Hep3B细胞,以MTT比色法检测细胞的增殖能力,以流式细胞术(Flow cytometry)检测细胞周期和凋亡情况,以Western blot法检测细胞中pAkt(S473,T308)和p-mTOR(S2448)的表达改变。 二、细胞株表达结果
1. PTEN在HepG2和Hep3B细胞中基本无表达,在QSG-7701细胞株中高表达,pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B细胞中的 表达较QSG-7701细胞均显著升高。 2. LY294002和RAPA均呈剂量-时间依赖的抑制HepG2和Hep3B细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002和RAPA作用24小时后,HepG2和Hep3B细胞均呈现明显的G0/G1期阻滞,处于S期的细胞比例较对照组显著减少 (P<0.01)。 3. 两给药组中HepG2细胞和Hep3B细胞的凋亡率与对照组比较均显著增加(P<0.01)。 4. 两给药组HepG2细胞的凋 亡率显著高于Hep3B细胞(P<0.01或P<0.05),并且HepG2细胞的凋亡率在RAPA给药组显著高于LY294002给药组 (P<0.01),但Hep3B细胞的凋亡率在两组间无显著差异。 5. 饱和效应浓度的LY294002作用48小时后,HepG2和Hep3B细胞中 pAkt(T308,S473)和p-mTOR(S2448)的表达水平较对照组均显著降低(P<0.01),饱和效应浓度的RAPA作用48小时后,HepG2和Hep3B细胞中P-mTOR(S2448)的表达水平较对照组均显著降低(P<0.01),而pAkt(T308,S473)的 表达水平较对照组均显著升高(分别P<0.01)。 三、结果分析
1. HepG2和Hep3B细胞存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的组成性激活。 2. LY294002和RAPA能有效阻断HepG2和 Hep3B细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制HCC细胞的生长增殖,诱导细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,且阻断效应与HCC细胞P53的表达有 关。 3. 一定浓度范围内,HepG2细胞对PI3K/Akt/mTOR信号通路阻断剂的敏感性高于Hep3B细胞,RAPA对PI3K/Akt /mTOR信号通路的部分阻断效应优于LY294002。 |
其他 |
一、PI3K简介
PI3K是细胞内重要的信号转导分子,根据PI3K的P110亚基结构特点和底物分子不同可将其分为三大类,其中第Ⅰ类 PI3K 功能最为重要,下面所述 PI3K 指的都是第Ⅰ类 PI3K。 PI3K主要由催化亚基 P110 和调节亚基 P85 组成。PI3K 可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号刺激激活。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化,催化肌醇环上3位羟基生成3,4 二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate,PI-3,4P2)及 3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PI-3,4,5P3),它们均可作为第二信使在细胞中传递信号,介导 PI3K 的多种细胞功能,如这些脂质产物可通过与 Akt 的 PH(pleckstrin homology)区结合来激活Akt。肿瘤抑制基因pten(phosphatase and tensinhomologdelet-edonchromosometen)表达产物可诱导3磷酸肌醇去磷酸化,从而可对 PI3K 途径进行负调节。 二、Akt简介
Akt是一种Ser/Thr蛋白激酶。在磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶(phosphoinositide-dependent protein kinase,PDK)的协同作用下,PI-3,4P2 和 PI-3,4,5P3 可与Akt结合,导致Akt从胞浆转位到质膜,并促进 Akt 的 Ser473 和 Thr308 位点磷酸化。
Ser473或/和Thr308 位点的磷酸化是Akt激活的必要条件,而Akt激活是其发挥促细胞生存功能的重要前提。激活的 Akt 主要通过促进 Bad(Bcl-2 家族促凋亡成员之一)、mTOR、Caspase 3、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应,包括抗凋亡、促细胞生存等功能。 三、mTOR简介 mTOR也被称为FRAP(FKBP-rapamycin-associated protein),属于磷酸肌醇激酶3相关激酶(PIKKs)家族的一员,是PI3K/Akt的下游底物,可通过改变翻译调节因子4E-BP1(真核细胞启动因子4E结合蛋白)和 p70S6k的磷酸化状态启动翻译过程。 去磷酸化状态的4E-BP1能与翻译起始因子eIF-4E结合,从而使后者丧失活性,而磷酸化的4E-BP1可解离释放eIF-4E,从而使后者结合于 mRNA 5'端起始点启动翻译过程。p70S6k磷酸化可通过促使40S核糖体蛋白S6磷酸化而启动翻译。PI3K/Akt/mTOR 信号通路在正常和肿瘤细胞的增殖和生存中具有重要作用,以抑制mTOR为主要作用原理的抗肿瘤药物已经进入临床开发的早期阶段。 |
实验方法原理 | 观察阿霉素(Doxorubicin,DOX)单用或与RAPA联合用药对HepG2和Hep3B细胞生物学行为及PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响,探讨mTOR抑制剂增强HCC化疗药物疗效的相关作用机制。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、细胞表达检测
1. 分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞,以不同浓度的DOX单用或与RAPA(20 nmol/ml)联合应用培养48 h或24h。 2. 以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用,以流式细胞技术检测二者的凋亡情况,以 Western blot法检测者P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)的表达改变。 二、细胞表达结果
1. 0.156~2.5 mg/L浓度范围内,DOX能抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,且呈浓度依赖性;DOX在0.625~10mg/L浓度范围内,Hep3B细胞的相对存活率显著大于HepG2细胞(P<0.01)。 2. 与DOX单用比较,DOX(0.156~2.5 mg/L)与RAPA联用显著降低了HepG2和 Hep3B细胞的存活率(P<0.01或P<0.05),DOX(0.156~10mg/L)与RAPA联用,Hep3B细胞存活率显著大于 HepG2细胞(P<0.01)。 3. DOX(0.156~10 mg/L)单用或与RAPA联用24h均可诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡发生,且 随DOX浓度增加,凋亡牢升高。 4. 与DOX单用比较,DOX(1.25~10 mg/L)与RAPA联用,HepG2细胞捌亡率较显著升高 (P<0.01或P<0.05),DOX(2.5~10 mg/L)与RAPA联用,Hep3B细胞凋亡率显著升高(分别P<0.05)。 5. DOX(5.0~10mg/L)单用,HepG2细胞凋亡率显著大 于Hep3B细胞(分别P<0.05),DOX(2.5~10 mg/L)与RAPA联用,HepG2细胞凋亡率显著大于Hep3B细胞(分别P<0.01)。 6. RAPA(20nmol/L)、DOX(2.5mg /L)以及二者联用均可导致HepG2或Hep3B细胞P-p70S6K(T389)、P-4E-BP1(S65)和pS6(S235/236)表达减 少,且以DOX与RAPA联用效应最为明显。 三、细胞表达结果分析
1. DOX可抑制HepG2和Hep3B细胞生长增殖,促进细胞凋亡,下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度。 2. DOX与 RAPA联合用药能显著抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,促进细胞凋亡,下调PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度,并在一定浓度范围内表 现出协同效应。 3. 在一定浓度范围内,HepG2细胞对DOX单用或与RAPA联合用药的敏感性显著高于Hep3B细胞,可能与HCC细胞p53的表达 差异有关。 |
实验方法原理 | 分析人HCC组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化水平与p53的表达及HCC临床病理参数之间的关系,评估PI3K/Akt/mTOR信号通路在HCC诊断和预后评价中的作用。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、细胞表达检测
1. 76例HCC组织样本经临床病理分期分级。 2. 免疫组织化学方法检测HCC组织和癌旁组织中p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6的表达情况。 3. 分析上述指标在不同HCC病理特征条件下的阳性表达率,并与正常肝组织比较。
二、细胞表达结果
1. p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6在人HCC组织有不同程度的表达,HCC组织p53(60.5%,46/76)、 pAkt(92.1%,70/76)、p-mTOR(84.2%,64/76)和pS6(88.2%,67/76)的阳性表达比例较癌旁肝组织(分别为 10.5%,8/76、63.2%,48/76、46.1%,35/76、52.6%,40/76)和正常肝组织(分别为0%、55.0%,11/20、 50.0%,10/20、45.0%,9/20)显著升高(P<0.01),而PTEN(65.8%,50/76)的阳性表达比例较癌旁肝组织 (89.5%,68/76)和正常肝组织(85.0%,17/20)显著减少(P<0.05)。 2. p53阳性表达HCC组织pAkt、p-mTOR和 pS6的阳性表达率较p53阴性表达组织显著升高(P<0.01),而PTEN的阳性表达率较p53阴性表达组织显著降低(P<0.01)。 3. 低分化、存在血管侵袭、TNM分期高的HCC组织p53、pAkt、p-mTOR和pS6的阳性表达率较相对应的分化较好、无血管侵袭、TNM分期低的HCC 组织显著升高(分别P<0.01或P<0.05);而PTEN的阳性表达率显著降低(分别P<0.01或P<0.05)。
三、细胞表达结果分析
1. 人HCC组织存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。 2. 人HCC组织PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度与p53的表达可能有相关性。 3. 人HCC组织PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化程度与HCC的临床病理特征有关,活化程度越高的HCC其分化程度越低、血管侵袭多发、TNM分期高。 |
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