1. 转染前,10cm培养皿中接种大约10%——20%皿底面积的包装细胞。
2.将10μg含抗药基因的逆转录病毒质粒DNA加入0.5mL HeBs中,加入32μL 2mol/LCaCL2,轻振动,加盖30分钟,室温下培养45分钟,直到小的、模糊的兰色沉淀产生。
3. 从包装细胞中弃去旧液,轻轻滴入HeBs-DNA沉淀于细胞培养皿中心,使细胞接触DNA20分钟,每10分钟轻轻摇动培养皿,使溶液均匀,加入10mL培养液,并于37℃放置4小时。
4. 完全吸出培养液,逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油,放回培养箱继续培养,如果使用的是ψ2/YCRE/YCRIP/PA317包装细胞系,需培养3.5分钟,若为Q2bn包装细胞系,需培养1.5分钟,或根据不同包装细胞选用不同时间。迅速弃去HeBs/甘油,用10mL培养液洗2次,加入含有血清的5ml培养液培养18——24小时。
5. 取出培养液用0.45μm过滤,可获得含有短期产生病毒的培养上清,-70℃或-80℃贮存,或立即用于其它包装细胞系的感染。
6. 加入10ml培养液于上述已感染的细胞,继续培养2——3天,继续步骤10。
7. 另一包装细胞受感染前1:10或1:20传代。8.倒去包装细胞的培养液,加入步骤5获得的病毒。方法如下:
对于10cm培养皿,将0.1至1.0mL病毒贮存液稀释至3——5mL的终体积,加入800mg/L聚凝胺至终浓度为8 mg/L,培养1小时以上。
9. 若10cm培养皿加入10mL培养液,6mL培养皿中应加入4mL培养液,培养2——3天。
10. 步骤6或步骤9得到的感染细胞,2——3天后按1:10或1:20传代,接种于选择培养液培养3天,更换培养液,继续培养3——4天,直至克隆出现。
11. 用克隆环挑出分离的克隆,每个克隆接种24孔板或6孔板中的二个孔,生长至50——90%底部面积。
12. 倒去培养液,换入1倍体积的培养液,继续培养1——3天,收取培养液,马上滴定,或者贮存于-70℃或-80℃。
13. 继续传代克隆细胞直到能被冷冻或被鉴定,若病毒产生克隆被鉴定,10%——15%DMSO保护剂液氮冻存细胞。即产生病毒细胞系建立。 |