1 实验准备与操作标准
实验全程按细胞培养标准进行准备与操作业,涉及卵子的步骤在体视显徽镜监控下进行。
2 动 物
8-12周龄金黄地鼠;纯系鼠料饲养,每日补充鲜胡萝b 20-30g/只;自然光照,光/暗时间比约为14/10h;室温16-30℃。选用8-20周龄鼠用于超排卵实验。
3 培养液配制
采用通用的Bww培养液。配制程序参照MarLinE稍加改良。试剂均为国产分析纯,三蒸水或蒸馏去离子水配制 。贮备液配方见表1,于800ml水中侬次溶入1-4;用 50ml水单独溶解 5后加入,再依次溶入6-12。此时溶液呈红色pH约 7.8。4℃贮存 。2月内使用 。
工作液 (BWW )配制程序:l00ml 贮备液中依次溶入碳酸氢钠210mg,葡萄糖 l00mg,乳酸钠糖浆(70-80 )0.325ml,人血清白蛋白350mg。用 1.0mol/LHEPES或碳酸氢钠调 pH 8.0土0.1;0.45μm和0.22μm微孔滤膜先后过滤;分装密 封,4℃贮存,1周内使用 。
4 地鼠超排卵与卵子制备
选动情周期第1天 (见阴道乳白色分泌物)雌 鼠,上午8——9时腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG )30—— 40IU/只;56——61 h后注射人绒膜激素(hCG)等量;17h后断头解剖,取出输卵管放入预 冷 (4℃)BWW 中,针刺腹壶部取卵并洗净;0.1 %透明质酸酶消散颗粒细胞:洗净卵子 ;0.05% 胰酶消化透明带并洗净。制得卵子立即用于授精或放在甲基硅油复盖的Bww 中,4℃存 放4h内使用 。在1次实验 中将 23只条件相似的地鼠分为2组 ,分别于注 射 PMSG 56和 61h后注射 hCG,取卵后计数每只排卵数 ,比较两组排卵效果 。
5 精液处理与精子获能
人 :正常生育力青年男子按摩采集精液。液化精液用双层撩镜纸过滤;取 0.4ml精液注入 2mlBWW(于 5ml试管 )底 部 ,37℃斜置培养1h;竖起 5 min,吸出80 %上层液即得活精子悬液 。离心洗涤2遍并调整精子浓度为 l×l06/ml左右 。将此悬液lml置于1.5 ml塑料离心管巾密封培养 (37℃,5h)以使精子获能。
小 鼠:8-12周龄ICR小鼠,断头 剖 出附睾 ,剔净周围组织,剪下附睾尾放入0.2ml Bww中剪碎 ;37℃培养 5 min使精子游出;吸取精子悬液稀释至 (1-2)×l0ml,培养3h。
6 授精
去透明带地鼠卵经 37℃预培养 5min;吸取10-20颗卵子置塑料培养皿 (15mm×30mm,)中成球形小滴 ,注入获能精子50μL,滴上灭菌甲基硅油覆盖液面 ,于37℃ ,饱和湿度中培养 2-3h。
7 检查
授精后卵子 Bww 洗涤3遍除去贴 附精子 ;将卵子放于4角滴有特制软蜡 (凡士林 ;石蜡 一9:l,V:V)的载片中央 ,加上盏玻片(2.1mm×2.1mm)。轻压4角使卵子压扁 ;相差显微镜观察 。 卵内有膨大透亮精子头或 2个以上原核井伴精子尾判断为受精;受精率 (FR)=受精卵数/检查卵数× 100 。
8 重复实验与质量控制
按以上程序进行了多次重复实验。人精子16例次,小鼠精子8例次 。实验质量控制采用同一精液标本在同一次实验中分成7个平行样,不同操作者平行操作,量后分别计算FR,求出均 数及 其变异系数 (CV),以 CV≤l5 为合格]。 |