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实验方法原理 |
ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪),采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳,应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法),因此通过单引物PCR测序反应,生成的PCR产物则是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物,使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳,从而避免了泳道间迁移率差异的影响,大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同,在毛细管电泳中的迁移率也不同,当其通过毛细管读数窗口段时,激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测,激发的荧光经光栅分光,以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光,并在CCD摄影机上同步成像,分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列,从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。
它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物,包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一,避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集,分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器,使DNA测序缩短至2.5h,PCR片段大小分析和定量分析为10~40min。
由于该仪器具有DNA测序,PCR片段大小分析和定量分析等功能,因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析,临床上可除进行常规DNA测序外,还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 一、准备工作
1. BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix,内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP,AmpliTaq DNA polymerase FS,反应缓冲液等。
2. pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2 g/L,试剂盒配套试剂。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT,3.2 umol/L,即3.2 pmol/ul,试剂盒配套试剂。
4. DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 ul为宜。本实验测定的质粒DNA,浓度为0.2 g/L,即200 ng/ul。
5. 引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物,配制成3.2 μmol/L,即3.2 pmol/ul。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物,如M13(-21)引物,T7引物等。
6. 灭菌去离子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 盖体分离,PE公司产品。
8. 3 mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸馏水中,冰醋酸调pH至5.2,定容至100 ml,高压灭菌后分装。
9. 70%乙醇和无水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml无水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混匀,室温可保存1年。
11. POP 6测序胶 ABI产品。
12. 模板抑制试剂(TSR) ABI产品。
13. 10x电泳缓冲液 ABI产品。
14. ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。
15. 2400型或9600型PCR仪。
16. 台式冷冻高速离心机。
17. 台式高速离心机或袖珍离心机。
二、PCR测序反应
1. 取0.2 ml的PCR管,用记号笔编号,将管插在颗粒冰中,按下表加试剂:
所加试剂 测定模板管 标准对照管
BigDye Mix 1 ul 1 ul
待测的质粒DNA 1 ul -
pGEM-3Zf (+) 双链DNA - 1 ul
待测DNA的正向引物 1 ul -
M13(-21)引物 - 1 ul
灭菌去离子水 2 ul 2 ul
总反应体积5 μl,不加轻矿物油或石蜡油,盖紧PCR管,用手指弹管混匀,稍离心。
2. 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98℃变性2 min后进行PCR循环,PCR循环参数为96℃ 10 s,50℃ 5 s,60℃4 min,25个循环,扩增结束后设置4℃保温。
三、醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物
1. 将混合物离心,将扩增产物转移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸钠/乙醇混合液,充分振荡,置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃离心30 min,小心弃上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗涤沉淀2次。12 000 r/min于4℃离心5 min,小心弃上清和管壁的液珠,真空干燥沉淀10~15 min。
四、电泳前测序PCR产物的处理
1. 加入12 μl的TSR于离心管中,剧烈振荡,让其充分溶解DNA沉淀,稍离心。
2. 将溶液转移至盖体分离的0.2 ml PCR管中,稍离心。
3. 在PCR仪上进行热变性(95℃ 2 min),冰中骤冷,待上机。
五、上机操作
1. 按仪器操作说明书安装毛细管,进行毛细管位置的校正,人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。 2. 仪器将自动灌胶至毛细管,1.2 kV预电泳5 min,按编程次序自动进样,再预电泳(1.2 kV,20 min),在7.5 kV下电泳2 h。 3. 电泳结束后仪器会自动清洗,灌胶,进下一样品,预电泳和电泳。 4. 每一个样品电泳总时间为2.5 h。 5. 电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。 六、序列分析
仪器将自动进行序列分析,并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知,可通过序列比较以星号标出差异碱基处,提高工作效率。 七、仪器清洗
测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。 八、计算
1. 测序反应精确度计算公式:100%-差异碱基数(不包括N数)/650x100%。
2. 差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基,N为仪器不能辨读的碱基。
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注意事项 |
1. ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器,需专人操作、管理和维护。
2. 本实验测序PCR反应的总体积是5 ul,而且未加矿物油覆盖,所以PCR管盖的密封性很重要,除加完试剂后盖紧PCR管盖外,最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4~4.5 ul ,则此PCR反应可能失败,不必进行纯化和上样。
3. 作为测序用户来说,只需提供纯化好的DNA样品和引物,一个测序PCR反应使用的模板不同,需要的DNA量也就不同,PCR测序所需模板的量较少,一般PCR产物需30~90 ng,单链DNA需50~100 ng,双链DNA需200~500 ng,DNA的纯度一般是A260 nm/A280 nm为1.6~2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解DNA,不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2 pmol/ul 较好。
4. 本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒,一般可测DNA长度为650 bp左右。本仪器DNA测序精确度为(98.5±0.5) %,仪器不能辨读的碱基N<2%,所需测定的长度超过了650 bp,则需设计另外的引物。为保证测序更为准确,可设计反向引物对同一模板进行测序,相互印证。对于N碱基可进行人工核对,有时可以辨读出来。为提高测序的精确度,根据星号提示位置,可人工分析该处彩色图谱,对该处碱基作进一步核对。
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实验方法原理 |
DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3'-OH末端上进行的。由于2’,3’-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3'-位脱氧而失去游离-OH,当它参入到DNA链后,3'-OH末端消失,使DNA链的延伸终止。
本实验根据此原理,将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体,并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火,随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行,分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物,其中―种dATP为32 P标记物,以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中,分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP),这样ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上,使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP,反应结束时,管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段,而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳,DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离,短的走在前端,长的泳动在后面。其他3管则分别为以G,C或T结尾的不同长度DNA片段。
由于:①即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段,亦可根据其电泳距离的差异而加以区分;②A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时,由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、试剂与器材准备
1. 试剂
(1)退火缓冲液:1 mol/L Tri-HCl(pH7.6),l00 mmol/L MgCl2 和160 mmol/L DTT。
(2)通用测序引物:5'-d[CGTAAAACGACGGCCAGT]-3',在水溶液中(5 pmol/ul)。
(3)T7DNA聚合酶(8 ug/ul):在加有甘油的缓冲液中,应储于-20℃,用时吸取1份后迅速放回。稀释液可在4℃保存l周。
(4)酶稀释缓冲液:20 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5 mmol/L DTT,100 ug牛血清白蛋白/m1,5%甘油。
(5)标记用混合物(Labelling Mix):dCTP,dGTP和dTTP各1.375 um,333.5 mmol/L NaCl。
(6)模板:10 ug单链M13mpl8 DNA在50 uLTris-EDTA缓冲液中。
(7)"A"mixshort:dCTP,dGTP和dTTP各840 umol/L,93.5 umol/L dATP,14 umol/L ddATP,40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6),50 mmol/L NaCl
(8)"G"mixshort;dATP,dCTP和dTTP各840 umol/L,93.5umol/LdGTP,14 umol/L ddGTP,40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6),50 mmol/LNaCl。
(9)"C"mixshort:dATP,dGTP和dTTP各840 umol/L,93.5 umol/L dCTP,14 umol/L ddCTP,40 mmol/L Tris- HCl(pH7.6),50 mmol/LNaCl。
(10)"T/mixshort:dATP,dCTP和dGTP各840 umol/L,93.5 umol/L dTTP,14 umol/L ddTTP,40 mmol/L Tris-HCl(pH7.6),50 mmol/LNaCl。
(11)终止液:溴酚蓝和二甲苯腈蓝FF各3%,10 mmol/L EDTA(pH7.5),97.5%去离子甲酰胺。
(12)标记脱氧核苷酸:[α-32 P]dATP,10 mci/ml,3 000 ci/mmol。
(13)显影剂
(14)定影剂
2. 器材
恒温加热器或恒温水浴槽;涡旋振荡器;台式高速离心机;恒功率电泳仪;测序用电泳槽(附玻板及隔离条)盖革计数器;可调式加样器;微量离心管(Eppendorf管);胶带;剪刀;手术刀;烧杯(100 ml);梨形瓶(100 ml);水泵;注射器(50 ml);注射器针头(18号);新华滤纸(3号)或Whatman滤纸(1号);保鲜膜;凝胶干燥器材;抽气泵;增感屏;X光胶片;显影及定影用具。
二、单链模板与引物退火
1. 用无菌蒸馏水按1:5稀释通用引物(约4.44 ug/ml)。
2. 取1.5 ml微量离心管1只,加入下列试剂:模板DNA(1.5-2 ug DNA/10 ul)10 ul;稀释通用引物2 ul 退火缓冲液2 ul,总体积14 ul。
三、链延伸/终止反应
1. 稀释T7DNA聚合酶:取2 ul(或4 ul)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中,加入0.5 ul(或1 ul)T7DNA聚合酶,用加样器轻轻抽吸和排出而混匀,置冰浴中待用。
2. 另取4只微量离心管,分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5 ul分别加入这4只微量离心管中,置37℃预温1分钟以上 (说明:4种mix液各又分为short和long两种,前者中ddNTP浓度较高,用于<500 bp的DNA片段的测序,后者用于50-1 000 bp片段的测序。一般应用short即可)。
3. 标记反应:在操作(1)的微量离心管中加入下列试剂:模板/引物14 ul(已有);标记用混合物(1abellingmix)3 ul;已标记混合物(1abelled mix)1 ul,T7DNA聚合酶稀释液2 ul。总体积20 ul。轻轻混匀,简短离心,置室温5分钟,立即接下步反应。
4. 从“标记反应”混合物中,分别取4.5 ul加于4只预温的反应液中(注意:每一次转移均应换用新的吸头),轻轻混匀。简短离心,37℃保温5分钟。
5. 向每只离心管中加入5 ul反应终止液,混匀,简短离心。
6. 变性反应:在电泳前进行。在上述链延伸反应终止后,最好即时进行变性反应并电泳,如不能及时电泳,终止反应后样品可储于冰浴或4℃。
7. 另取4只微量离心管,标好“A”、“G”、“C”和“T”。从上述每一链延长/终止反应的试管中取3 ul,分别加入4只已标号的相应微量离心管中,75-80℃加热2分钟,立即各取1.5-2 ul点样、电泳。
四、制备电泳凝胶及电泳
1. 制备胶模:取双块制胶玻板,先用泡沫海绵沾"洗洁净"液仔细擦洗,用水彻底淋洗,干燥后继用酒精清洗,晾干,再用硅烷剂(repel-silane)将玻板的―面擦一遍,蒸馏水淋洗,干燥 (注意:清洗时应戴一次性手套操作)。
将其中一块玻板平置台上(硅烷处理过的―面朝上),两侧各放置一条隔离条(最好选用上方厚为0.2 mm,下方厚0.4 mm的楔形条),另取―块玻板(硅烷化处理过的―面朝下),对准放置在上述玻板上,两侧及―面边缘用胶带封严,并用文具夹夹紧,制成胶模。
2. 配制电泳凝胶:向1只100 ml烧杯中加入下列试剂;20%丙烯酰胺溶液20 ml;10xTBE缓冲液5 ml;46.7%尿素溶液25 ml。总体积50 ml(凝胶的丙烯酰胺浓度为8%)。混匀,过滤除去不溶物,置100 ml梨形瓶中连接水泵抽气5分钟,加入250 ul 10%过硫酸铵,50 ulTEMED混匀。
3. 注胶:立即将配好的凝胶用50 ml注射器小心注入制好的玻板胶模中(胶模宜倾斜45度左右),注意防止气泡,如有气泡产生,可敲击该部位玻璃,使气泡上升排除。从上面插入梳齿背,深入胶面约10-12 mm。将胶模水平放置45-60分钟,待凝胶聚合。
4. 电泳:凝胶聚合后,拨掉梳齿,撕去玻板下缘胶带,用蒸馏水淋洗凝胶表面,以除去未聚合物质。将胶板装置在电泳槽上,上下槽加入缓冲液,注意排除凝胶下缘气泡。接通电源,40 W预电泳45-60分钟。预电泳结束后,断电。插入样品梳,梳齿向下插入凝胶中3 mm左右。用缓冲液小心冲洗每一加样小槽(齿间空隔),用记号笔标明A、G、C和T4个小槽,每槽加入变性后的链延伸/终止液1.5-2 ul。接通电源,40 W恒压,电泳至示踪染料溴酚蓝至底边时切断电源。如待测片段较长而需继续点样,则等示踪染料二甲苯腈蓝称至距下缘4-5 cm时切断电源,用缓冲液冲洗另一组4个加样小槽(应与前一组相隔1-2个加样小槽),重复上样操作,然后继续电泳至第2组示踪染料溴酚蓝移至玻板下缘时断电,停止电泳。
五、放射自显影及结果分析
1. 将凝胶板自电泳槽取下后水平放置,小心分离两块玻板,让凝胶完好地留在其中一块玻板上。可将凝胶切下一小角以示方向。
2. 在凝胶上小心地覆盖一张厚的3号新华滤纸,移去玻板,在凝胶另一面覆盖一张保鲜膜,注意排除气泡。滤纸面朝下置凝胶干燥器中干燥。
3. 于暗室中,将干燥的凝胶的保鲜膜面与一张X光底片的药膜面贴合,夹在增感屏盒中,置70℃或室温曝光4-16小时,然后显影、定影(按所用显影及定影剂说明进行),水漂洗、干燥。然后由下而上读序。
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注意事项 |
一、操作顺序参考表
1. 制备电泳凝胶(可在前一天下班前进行)。
2. 检查实验计划及试剂。
3. 预电泳。
4. 预电泳的同时进行引物退火、链延伸及终止反应。
5. 点样并电泳(根据需要可重复1-2次)。
6. 固定、干燥凝胶。
7. 放射自显影。
二、M13重组子的培养
1. 挑取单一的大肠杆菌集落加入3 ml LB培养基中,37℃振荡培养直至A600光密度达到0.8-1.0为止。
2. 取200 ul上述大肠杆菌培养物,加入含有2 ml 2xYT培养基的试管中,再将插入待测DNA片段的M13单一白色噬菌斑接种其中,在37℃剧烈振荡培养至少5小时,但不宜超过8小时。
3. 通过两轮离心将细胞除去,第2轮的上清液小心转移至另一清洁试管中。存放4℃待用。
三、单链模板的分离
1. 沉淀M13:在上述M13培养物上清中,加入0.2倍体积的3.5 mol/L醋酸铵/20%多聚乙二醇溶液,颠倒混匀数次,置冰浴30分钟。离心15-30分钟(11 000 g)可见白色噬菌体沉淀。小心除去上清液,可将试管倒置并吸去多余液体。
2. 分离纯化模板:向沉淀中加入TE缓冲液100 ul,轻轻混匀使沉淀重悬,(以下步骤可在微量离心管中进行)。再加等体积酚/氯仿试剂,旋转振荡30秒,离心1分钟使分层。小心将上层液转移至另―干净离心管中。用酚/氯仿重复抽提一次并转移上层液。
3. 加等体积氯仿,离心,转移上层液至洁净管中,并重复1次。
4. 加1/10体积3 mol、L醋酸钠(pH7.5)及两倍体积100%乙醇,混合,置干冰(或-40℃冰箱)中15分钟,离心10分钟,除去上清,加冰冷的70%乙醇l ml,离心,除去上清,于真空条件短暂干燥。
5. 加入20 ul Tris缓冲液溶解DNA沉淀,储于-20℃待用。
6. 用于测序的DNA,其A260/A280光密度比值至少应大于1.7。
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实验方法原理 |
Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统,它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。 银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速,廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序,这是常规的放射性测序法做不到的。 此外,SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物,减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作,也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外,也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。
Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品,对于双链DNA模板有非常好的效果,具有高度的准确性,能产生均一的条带,且背景低。
SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物,如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP,或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。
退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时,聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域,它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因,应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说,较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明,>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。
由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带,测序反应需要0.03~2pmol模板DNA,随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程,变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构,允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、试剂准备
1. SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。
2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液(38%丙烯酰胺 W/V,2%甲叉双丙烯酰胺 W/V):95 g丙烯酰胺,5 g甲叉双丙烯酰胺溶于140 ml 双蒸水中,定容至250 ml,0.45 mm过滤器过滤后,贮于棕色瓶中,置于4℃冰箱可保存2周。
3. 10%过硫酸铵,0.5 g过硫酸铵溶于4 ml水中,定容至5 ml,应新配新用。
4. 10xTBE缓冲液(1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸,10 mmol/L EDTA): 121.1 g Tris,51.35 g硼酸,3.72 g Na2EDTA·2H2O,溶于双蒸水中定容至1升,置于4℃下可贮存2周,其pH约为8.3。
5. TBE电极缓冲液:10xTBE 缓冲液稀释至1xTBE备用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液:10%冰醋酸(V/V)配制2升备用。
8. 染色溶液:硝酸银2 g,甲醛3 ml,溶于2升超纯水中备用。
9. 显影溶液:60 g碳酸钠(Na2CO3)溶于2升超纯水中,使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸钠溶液(10 mg/ml)。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。
二、测序反应
1. 对于每组测序反应,标记四个0.5 ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2 ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20 ul)矿物油,盖上盖子保存于冰上或4℃备用。
2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂:
(1) 样品反应:
质粒模板DNA :2.1 pmol
5x测序缓冲液 : 5 ml
引物: 4.5 pmol
无菌ddH2O 至终体积16 ml
(2)对照反应
pGEM-3Zf(+)对照DNA(4 mg) :4.0 ml
5x测序缓冲液: 5 ml
pUC/M13正向引物(4.5 pmol) :3.6 ml
3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0 ml测序级Taq DNA聚合酶(5 u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。
4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。
5. 在微量离心机中离心一下,使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪,以【注意】中循环模式为基准,开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。
7. 热循环程序完成后,在每个小管内加入3 ul DNA测序终止溶液,在微量离心机中略一旋转,终止反应。
【注意】
(1)测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入:
模板种类/长度 模板量
200 bp(PCR产物):16 ng(120 fmol)
3000~5 000 bp(超螺旋质粒DNA): 4 mg(2 pmol)
48 000 bp(λ,粘粒DNA): 1 mg(31 fmol)
由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱,因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。
(2)计算与4.5 pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式:
4.5 pmol=1.5 ngxn,其中n为引物碱基数
计算与1p mol相当的引物微克数可用以下一般公式:
dsDNA:1 pmol=(6.6x10-4 mg)xn,其中n为模板碱基对数
ssDNA:1pmol=(3.3x10-4 mg)xn,其中n为模板碱基数
(3)为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物, 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式,建议从模式1开始。
模式1:适用于引物<24碱基或GC含量<50%
95℃ 2分钟,然后: 95℃ 30秒(变性),42℃ 30秒(退火),70℃ 1分钟(延伸)。
模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分钟,然后:95℃ 30秒(变性),70℃ 30秒(退火/延伸)。
(4)在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。
三、测序凝胶板的制备
1. 玻璃板的处理
银染测序的玻璃板一定要非常清洁,一般先用温水和去污剂洗涤,再用去离子水冲洗玻璃板,除去残留的去污剂,最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
(1)短玻璃板的处理
① 在1 ml95%乙醇,0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷(Bind Silane),配成新鲜的粘合溶液。
② 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板,整个板面都必须擦拭。
③ 4~5分钟后,用95%乙醇单向擦玻璃板,然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程,每次均须换用干净的纸,除去多余的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷,使凝胶不能很好地粘附。
② 准备长玻璃板之前要更换手套,防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的,否则将导致凝胶撕裂。
(2)长玻璃板的处理:
① 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。
② 5~10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10%NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染,用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开,如果出现交叉污染,以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。
2. 凝胶的制备
(1)玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后,即可固定玻璃板。该方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的边条置于玻璃板左右两侧,将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘,用夹子固定住。
(2)根据所需要的凝胶浓度,按下表制备测序凝胶,一般6%~8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中,先用适量双蒸水溶解尿素,再加入Acr&Bis和10xTBE缓冲液,再用双蒸水调终体积至99.2 ml,并用0.45 mm的滤膜过滤,然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后,方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4~6分钟,即开始聚合,如果聚合不好,则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
(3)胶配制好后,即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中,倒完后,静止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夹子固定玻璃板时,最好夹子的力量稍大一些,防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
② 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡,否则影响测序的结果。
四、电泳
1. 预电泳
(1)当凝胶聚合完全后,拨出鲨鱼齿梳,将该梳子反过来,把有齿的一头插入凝胶中,形成加样孔。
(2)立即将胶板固定在测序凝胶槽中,一般测序凝胶槽的上下槽是分开的,因而只有在固定好凝胶板后,方能加入TBE缓冲液。
(3)稀释10xTBE缓冲液至1xTBE,将该缓冲液加入上下二个电泳槽中,去除产生的气泡,接上电源准备预电泳。
(4)有些电泳槽,如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的,则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热,依靠电泳过程中自身产生的热进行保温,如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽,这种槽需夹上二块散热铝板,使整个凝胶板的温度一致。
(5)按30 V/cm的电压预电泳20~30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子,同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构,影响测序的结果。
【注意】
① 用鲨鱼齿梳制作加样孔时,应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右,千万注意不能使加样孔渗漏,否则得不到正确的结果。
② 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏,否则极易造成短路而损坏电泳仪。
2. 样品的制备
当在预电泳时,即可进行样品的制备,将反应完毕的样品在沸水浴中加热1~3分钟,立即置于冰上即可。如果样品长时间不用,则应重新处理。可使用4~6%聚丙烯酰胺凝胶,胶厚0.4 mm。厚度小于0.4 mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油,但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。
3. 上样及电泳
关闭电泳仪,用移液枪吸缓冲液清洗样品孔,去除在预电泳时扩散出来的尿素,然后立即用毛细管进样器吸取样品,加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、T、C。加样完毕后,立即电泳。开始可用30 V/cm进行电泳,5分钟后可提高至40~60 V/cm,并保持恒压状态。一般来说,一个55 cm长,0.2 mm厚的凝胶板,在2500 V恒压状态下电泳2小时即可走到底部,同时在电泳过程中,电流可稳定地从28 mA降至25 mA。为了能读到更长的序列,可采用两轮或多轮上样。
【注意】
① 上样电泳时,一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右,如果还没有达到,则应等温度达到后才能上样电泳。
② 一般来说电泳时,不宜使用太高的电压,因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低,并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。
五、测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子,大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板,凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶:将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘,用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失,胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液,用于终止显影反应。
3. 洗胶:用超纯水振荡洗胶3次,每次2分钟。从水中取出,当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10~20秒,使水流尽。
4. 凝胶染色:把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影
(1)在显影溶液中加入甲醛(3 ml)和硫代硫酸钠溶液(400 ul)以完成显影液的配制。
(2)从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5~10秒。注意,把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5~10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3)立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2~3分钟或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶:在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次,每次2分钟,注意在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白,黄色背景(如纸)上观察凝胶,若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
【注意】
测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法,本系统的成败受几个因素的影响。
① 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR或Milli-QR的水)或双蒸水可获得较好的效果,如果水中有杂质,则低分子量条带可能无法出现。
② 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的,美国化学学会级碳酸钠较好,如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3,或Kodak Cat #109-1990),一般可获得较好的结果。
③ 色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长,银颗粒会脱离DNA,产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长,染色步骤可以重新进行。
④ 如果凝胶厚度超过0.4 mm或丙烯酰胺浓度高于4~6%,则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比0.4 mm薄,染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。
⑤ 在室温下进行所有步骤,显影反应除外。显影溶液必须预冷至10~12℃以减小背景杂色。注意:临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。
六、EDF胶片显影
使用EDF胶片可增强测序条带的对比度,如果测序胶上条带很淡,我们建议把数据转移至EDF胶片,银染胶在其影像转移至EDF胶片之后可增强条带可读性。
1. 在暗室内,将染色过的粘于玻璃板的凝胶(胶面向上)置于荧光灯箱上。如有合适的漫射板,亦可用白灯箱,为确保曝光时间,用一小条EDF胶片曝光不同时间,检查不同的曝光强度,一般曝光20~40秒可得较好结果。
2. 在红灯下找到EDF胶片有缺刻的一角,然后把胶片置于凝胶上,使缺口位于左上角。由于EDF胶片是单面的,因此必须确保缺口在左上角。
3. 在EDF胶片上放置一干净、干燥的玻璃板,开亮灯箱约20秒。
4. 用冲显放射自显影胶片的步骤手工显影EDF胶片,可使用下列操作过程:
(1) 在Kodak GBX显影液中显影1~5分钟;
(2) 水洗1分钟;
(3)在Kodak GBX定影液中定影3分钟;
(4)水洗1分钟。
【注意】
① 进行EDF胶片显影之前凝胶必须完全干燥。戴手套进行操作,以免印上指纹。同时注意EDF胶片不能用自动胶片处理器。
② 对于不同的光源最佳曝光时间可能不同,通过对一小条EDF胶片曝光不同时间以选择你所用光源的最佳曝光时间,参阅胶片说明书。
③ 曝光时间短则EDF胶片影像较深,曝光时间长则有助于减弱背景。
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注意事项 | 一、操作须知
成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏,而需要更多的模板量,此外,也不可能通过延长X光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此,请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性,并且注意如下几点:
1. DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定,样品应与已知量DNA一起电泳。
2. 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说,并不能给出一个可信的DNA浓度估计,混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260nm光吸收。因此,分光光度法常常错误地高估DNA浓度。
3. DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸,虽然它们在电泳后DNA样品的前面,并不能观察到,但它们仍会有260nm光吸收。
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实验方法原理 |
"鸟枪法"是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段,继而将这些片段与适当的载体结合,将重组DNA转入受体菌扩增,获得无性繁殖的基因文库,再结合筛选方法,从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株,从中将重组的DNA分离、回收。
这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因,其特点是绕过直接分离基因的难关,在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小,在相当程度上还得靠“碰运气”,所以人们称这个方法为鸟枪法或散弹枪实验法。
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实验步骤 |
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA,并用Agarose凝胶电泳进行回收。
二、对回收的大片段DNA用物理方法(如超声波等)进行切断处理,然后用T4DNAPolymerase对小片段DNA进行末端平滑化。
三、进行Agarose电泳,切胶回收1kbp~2kbp的小片段DNA。然后用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。
四、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中,然后转化,挑选克隆。
五、对阳性克隆(含1kbp~2kbpInsert)进行DNA测序。
六、对数据进行编辑,最后连成一条大片段的DNA序列。
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其他 |
一、DNA测序量
应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率),对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。
如:对100kbp的DNA片段进行测序时,可以按以下方法进行计算:
6倍测序量=100 000 Bases x6/600 Bases=1 000个反应
8倍测序量=100 000 Bases x8/600 Bases=1 333个反应
二、结果编辑
按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序,然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段(Contig)。
三、补缺工作
结果编辑工作结束后,会发现在数个DNA大片段(Contig)间的序列没有测定,此时应该通过primer walking来测序,进行整体DNA序列的补缺工作。
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实验方法原理 | 用化学试剂 处理具有末端放射性标记的DNA片段 ,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影后,可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、取待测DNA片段,既可以是单链也可以是双链。
此法又叫化学切割法,或化学降解法,切割之前先对待测片段作末端标记。用放射性P32-磷酸集团标记链的末端之一。
二、将标记完的样品,分成四份。分别采用不同的化学试剂对所得样品,进行修饰进而切割(切割就是利用特异的化学试剂,修饰DNA分子中不同的碱基,使被修饰的碱基之间的连接变得不稳定,发生断裂,而产生各种长度的DNA片段。)
【四组切割的方法,在G、G+A、T+C、C处切割】
"+就是同时切割,有点讨厌的是这点,能修饰A,使其糖苷键不稳定的甲酸,同时也会使G的不稳定,所以无奈就有了G+A并在一起,
(1)G反应,"硫酸二甲酯",使鸟嘌呤G的N7原子甲基化,而与脱氧戊糖之间的糖苷键不稳定,可在中性环境中受热断裂,得到一系列G末端的片段。
(2)G+A反应 "甲酸",使A和G嘌呤环上的N原子质子化,糖苷键变得不稳定,可用哌啶将其断裂,得到一系列A和G混合的末端的片段。
(3)T+C反应 "肼",使T和C的嘧啶环断裂,通过消除反应,使DNA链发生断裂,得到一系列T+C末端的片段。
(4)C反应 在NaCl存在时,只有C与肼反应,得到一系列C末端的片段。
三、形成大小不一的DNA链。
四、电泳分离DNA链。
五、根据同位素标记自显影后读出序列。
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其他 |
一、 待测DNA的末端标记
化学降解法测序首先要制备单侧末端标记的待测DNA片段。DNA片段的核素标记有三种方法:
1. 利用T4噬菌体多核苷酸激酶和γ-32P-ATP标记DNA的5-末端 对于去5′-磷酸化的DNA片段,T4噬菌体多核苷酸激酶可以通过正向反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基转移至DNA的5-末端;对于5'-磷酸化的DNA片段,在过量ATP条件下,该酶可以通过交换反应将γ-32P-ATP的γ-磷酸基与DNA的5-末端磷酸基发生交换反应而标记。但对于双链DNA片段,由于DNA的两侧均被标记,不能直接用于测序反应。需要经限制性内切酶切割,电泳分离二种不同大小的标记片段,或者直接用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离二条单链,但这种分离方法比较困难,较少使用。
2. 利用末端转移酶和α-32P-ddNTP标记DNA的3-末端 在二价阳离子存在下,末端转移酶催化dNTP加入DNA分子的3-羟基末端,如果作为底物的核苷酸经过修饰(如ddNTP),则可以在DNA的3-OH上仅加入一个核苷酸。对于双链DNA片段,亦存在DNA的两侧均被标记问题,可通过上述同样的方法分离。
3. 利用Klenow片段和α-32P-dNTP对限制性内切酶产生的3-凹进末端进行标记 这种方法能直接制备单侧末端标记的DNA,但要求待测DNA能满足下列条件之一:①DNA两端的一侧为3-凹进末端,而另一侧为平端或3-凸出末端;②两端虽均为3-凹进末端但末端单链结构不同,这时可选择不同的γ-32P-NTP来实现末端标记。这是对双链DNA进行不对称标记的常用方法,如图7-4-4所示。
CS载体系列(CS是chemical sequecing的缩写)是专门为化学降解法测序进行末端标记而构建的一类克隆载体,如pSP64CS和pSP65CS。这类载体最重要的特点是,在待测DNA克隆片段的附近有两个可被限制性酶Tth111识别的典型位点(GACN↓NNGTC,不对称),能在克隆DNA片段两侧不同的3-凹进末端,从而方便地实现对待测DNA的单侧标记。
值得特别注意的是,化学降解法对标记的待测DNA纯度有较高的要求,因为盐浓度会干扰肼对胸腺嘧啶的修饰,也会抑制A+G反应中的去嘌呤过程。因此,标记的DNA一般要经酚/氯仿抽提、70%乙醇洗涤除盐,并用去离子水溶解而不用TE缓冲液。
二、 碱基特异的化学切割反应
在化学降解法中,专门用来对核苷酸作化学修饰并打开碱基环的化学试剂主要有肼(hydrazine)和二硫酸甲酯(dimethylsulphate)。
肼又叫联氨(NH2-NH2),在碱性条件下,能作用于T/C的C4和/或C6原子位置,并同C4-C5- C6环化形成一种新的五元环。肼进一步作用释放出吡唑啉酮环。在六氢吡啶的作用下,通过β消除反应,该碱基两端的磷酸基团便会以磷酸分子形式从糖环上释放出来,从而导致在这个核苷酸位置上发生DNA断裂如果在此反应体系中加入1mol/L浓度的盐,则肼同T的反应速率会下降,便可发生C特异的化学切割反应。因此,可以根据这一特点来区别C和C+T这2种化学切割反应。化学反应过程如图7-21所示。
二硫酸甲酯[(CH3O)2SO2],能使DNA碱基环中的氮原子发生甲基化反应。在DNA测序分析中所涉及的甲基化位点是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH环境中,这2种碱基的甲基化作用,都足以导致其糖苷键发生水解作用,而留下失去碱基的糖-磷酸骨架。再通过碱催化的β-消除反应水解无碱基糖环两端的磷酸二酯键,造成DNA在此位点发生断裂。同时,已知DNA中G的N7原子甲基化速率比A的N3原子快4~10倍,故在中性条件下水解速率G位置也比A位置要快得多(差4~6倍),这是早期Maxam-Gilbert化学降解法测序辨别DNA中G和A的基本依据。现行的化学裂解反应,都采用六氢吡啶与DNA中的甲基化碱基反应,且这种反应对甲基化的G是特异的,因此这种DNA链的断裂也仅发生在G残基位点。化学反应过程如图7-22所示。
化学反应设有5组独立的反应:G反应(在G 残基上的裂解)、A+G反应(在嘌呤残基上的裂解)、C+T反应(在嘧啶残基上的裂解)、C反应(在C残基上的裂解)和A>C反应(在A和C 残基上的裂解),A>C反应也可以不做。
三、测序图谱的识读
对于测序电泳图谱的识读,化学降解法测序要比末端终止法较为复杂,因为化学裂解反应并非是完全绝对碱基特异的。每组测序图谱为5条或4条(A>C反应可以不做)泳道。需要通过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的存在。类似地,A残基的位置也要通过从A+G泳道中扣除G泳道的条带推断出来。同时,如果A>C泳道中出现较强的条带,则可确证A残基的存在。
实际读片时从胶片底部一个个地向顶部读取。从下至上,一个一个地从G+A泳道和C+T泳道二个列中确定只相差一个碱基的条带。如果在G+A泳道中出现一条带,就看G泳道中是否有相同大小的带,如果有即为G碱基,如果没有则为A碱基;同样,在C+T泳道中出现的条带,就检查C泳道中有无同样大小的条带,如果有即为C,无则为T。如果做了A>C反应,在该列中出现较强的条带时,可帮助A的确定。
四、化学降解法测序的优点
在化学降解法与链终止法问世之初,利用化学降解法进行测序不仅重复性更高,而且由于只需要简单的化学试剂和一般的实验条件,易为普通实验室和研究人员所掌握。而链终止法需要单链模板、特异的寡核苷酸引物和高质量的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow片段),这在二十世纪八十年代一般的实验室很难做到。但随着M13mp载体的发展、DNA合成技术的进步及Sanger法测序反应的不断完善,至今DNA测序已大都采用Sanger法进行。然而,Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序,可以分析DNA甲基化修饰情况,还可以通过化学保护及修饰等干扰实验来研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质的相互作用,这些仍然是Maxam-Gilbert法所独具的鲜明特点。
当然,如同双脱氧终止法一样,化学降解法测序的主要限制因素也是测序凝胶的分辨能力。化学测序法一般都用32P标记,所以与用32S标记作标记的末端终止法相比,它显示的条带较宽且有扩散现象,这限制了化学降解法在对较大DNA片段测序时的分辨能力。一般一块电泳胶上最多能读出200~250核苷酸序列。然而,如果按2个相反的取向分别从DNA片段的两端进行测序,则可克服这一不足。
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