一、连接反应
将约10ng的载体DNA转移到无菌微量离心管中,加入至少4倍摩尔量的外源DNA片段,然后加入10×T4 DNA连接酶缓冲液(ligase buffer)1μL,T4 DNA连接酶0.5μL——1μL,加无菌超纯水至10μL体积,充分混匀后用微量离心机将液体全部收集至管底,于16℃保温过夜。
二、E.coli DH5α感受态细胞的转化
1. 从一70℃冰箱中取200μL(效率高时只需50μL)感受态细胞悬液,置冰上解冻。
2. 待感受态解冻后加入连接产物溶液1IxL——51xL,轻弹混匀,冰上放置30rain。
3. 42℃水浴中孵育90s,并迅速置冰上冷却3min——5min。
4. 向管中加入lmL LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养lh,使细菌恢复生长,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp')。
5. 将上述菌液摇匀后取100μL(如感受态效率低或连接效率低则可将lmL菌液在4500 rpm低转速离心机中收集全部菌体,并重悬于100μL LB培养液中)涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置30min,待菌液完全被培养基吸收后,将培养皿倒置于37℃培养16h——24h。
①同时做三个对照
对照1:以等体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,涂板时只取5μL菌液涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。
对照2:以等体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,涂板时只取5μL菌液涂布于含有抗生素的LB平板上。此组正常情况下应没有菌落出现。
对照3:取一定量已知浓度的对照质粒DNA(为本实验中的连接载体质粒)加入等量感受态细胞中,其他操作与加入连接体系的相同。此对照在正常情况下应在含抗生素的LB平板上出现较大量的菌落。
②统计每个培养皿中的菌落数
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率,公式如下:
转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率(转化子数/mg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(mg)
感受态细胞总数=对照组1菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数
三、重组质粒的筛选与鉴定
带有T-vector的空载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在X-gal和IPTG培养基上为蓝色菌落;带有重组质粒转化子由于外源DNA片段的插人丧失了β-半乳糖苷酶活性,因而在X-gal和IPTG培养基上为白色菌落。
1. 质粒电泳初步鉴定重组子
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/mL的5mL LB液体培养基中,于37℃振荡培养12h。用碱裂解法小量制备质粒DNA进行电泳,同时制备T-vector做对照,有插人片段的重组质粒电泳时迁移率较T-vector慢。
2. 质粒酶切确定重组子
用与连接未端相对应的限制性内切酶对以上电泳中迁移率较慢的质粒进一步进行酶切检验,同时对空载体进行对照酶切,如果确实插人了外源DNA片断,就能在电泳中看到与插入片断大小一致的DNA条带。 |