一、碱变性法提取质粒DNA
1.接种细菌于5mlLB液体培养基中,37℃培养过夜。
2.3000rpm/min,离心15min,弃上清。加入100ul溶液Ⅰ悬起细菌沉淀。
3.加入200ul前新配制的溶液II,颠倒EP管5次混合均匀,置冰浴2min。
4.加入150ul溶液III温和地混匀,12000rpm/min,离心5min。
5.吸取上清清亮裂解液放入另一新EP管中,加等体积酚-氯仿-异戊醇抽提2次,12000rpm/min,离心2min。(若不做酶切,此步可省略)吸取上清放入另一新EP管中,加入二倍体积的冷乙醇,12000rpm/min,离心10min。
6.弃乙醇,干燥后用30ulTE缓冲液洗下核酸,待电泳检测。
二、琼脂糖凝胶电泳
1.取琼脂糖0.9g,加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中,100℃加热溶解。
2.平衡凝胶槽,放好两侧挡板,调节好梳子与底板的距离(一般高出底板0.5——1mm)。
3.铺板:在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液,轻轻混匀,待冷至50℃左右倒入凝胶槽,胶厚一般为5——8mm。
4.待胶彻底凝固后,去掉两侧挡板,将凝胶放入盛有电泳液的槽中(加样孔朝向负极端,DNA由负极向正极移动),使液面高出凝胶2——3mm,小心拔出梳子。
5.DNA样品与载体缓冲液5:1混合并加入凹孔中(样品不可溢出)。
6.打开电源,调节所需电压,电压与凝胶的长度有关,一般使用电压不超过5v/cm。
7.据指示染料移动的位置,确定电泳是否终止(溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA带之间)。
8.电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 |