标签: PCR 聚合酶 凝胶
聚合酶链式反应-单链构象多态(PolymeraseChainReaction-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP)技术可用于:(1)癌基因和抑癌基因突变的筛查检测;(2)遗传病的致病基因分析;(3)基因诊断,基因制图等领域。
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20 ml反应体系成分如下:
模板DNA(100 ng/ml) 1 ml
10×PCR反应缓冲液 2 ml
Taq DNA聚合酶(5 U/ml) 0.2 ml
4×dNTPs(2.5 mmol/L) 1 ml
MTHFR上下游引物 各 1 ml
ddH2O 加至终体积 20 ml
PCR反应循环参数:
95℃ 5 min;
94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s,共30个循环;
72℃ 7 min。
反应结束后,置4℃保存。
二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
1. 制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶:30%聚丙烯酰胺(交联度49:1)10 ml,5×TBE缓冲液10 ml,加蒸馏水至50 ml,加TEMED 25 ml、10%过硫酸铵250 ml,混匀后灌胶,插入加样梳子。待胶完全聚合后,拔出加样梳子,安装电泳装置,加入电泳缓冲液(1×TBE),缓冲液应高于加样孔上缘,用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。
2. 取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀,98℃变性10 min,迅速冰浴。
3. 取5 ml混合液加到点样孔中,以1——8 V/cm电泳4——5 h。
三、聚丙烯酰胺凝胶染色
1. 拆下电泳装置,取出聚丙烯酰胺凝胶,放到一个塑料盘内,用蒸馏水冲洗1——2遍。
2. 倒入固定液,固定8——10 min。
3. 用蒸馏水冲洗1——2遍;倒入银染液,银染10——12 min。
4. 用蒸馏水冲洗若干遍;倒入显色液,显色至出现清晰的银染带。
5. 用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶,观察PCR-SSCP结果。
四、结果判断
观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带,根据异常泳动变位筛查突变样本。
2. DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在16——18 cm以上。
3. 染色最好在塑料盘中进行。
4. 环境温度越高,聚丙烯酰胺凝胶越易凝固。应根据环境温度的变化调整
凝胶中10%过硫酸铵与TEMED的用量。
5. 电泳过程中应保持恒温,最好使用薄的凝胶和冷却系统以散发热量。
6. 用AgNO3染色时,染色时间需随环境温度变化作适当调整,环境温度越
低,所需的染色时间越长。
7. 显色时间不可过长,以免背景过深影响结果观察。
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