实验方法原理 | 质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42摄氏度短时间的热击处理,促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、实验材料准备
1. 器材
旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5 ml 微量离心管,双面微量离心管架,干式恒温气浴(或恒温水浴锅),制冰机,恒温摇床,培养皿(已铺好固体LB-Amp),超净工作台,酒精灯,玻璃涂棒,恒温培养箱。
2. 试剂
培养基(不加抗菌素),LB培养基(加抗菌素),无菌ddH2O,IPTG,X-gal。
3. 材料处理
无菌ddH2O,1.5 ml 离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲酰胺配)。 二、操作步骤
1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。
2. 从-70℃ 超低温冰柜中取出一管(100 ul)感受态菌,立即用手指加温融化后插入冰上,冰浴5~10 min。
3. 加入5 ul 连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100 ng),轻轻震荡后放置冰上20 min。
4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2 min进行热休克,然后迅速放回冰中,静置3~5 min。
5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 ul LB培养基(不含抗菌素)轻轻混匀,然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。
6. 在超净工作台中取上述转化混合液100-300 ul,分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话,滴完菌液后再在平板上滴加40 ul 2% X-gal,8 ul 20% IPTG,用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
8. 在涂好的培养皿上做上标记,先放置在37℃恒温培养箱中30~60 min 直到表面的液体都渗透到培养基里后,再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。
9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面,写实验报告。
10. 观察平板上长出的菌落克隆,以菌落之间能互相分开为好。注意白色菌斑。
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注意事项 | 1. 电击之前保持低温状态。 2.电击杯使用完,用针头蒸馏水反复冲洗杯底,再用70%乙醇浸泡,4℃存放,使用前烘干即可,或者烘干后,-20℃冰箱存放。 3.玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻,待其冷却后再涂。 |
实验方法原理 | 细菌处于0℃,CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面,经过42°C短时间的热击处理,促进吸收DNA,然后在非选择培养基中培养一代,待质粒上所带的抗菌素基因表达,就可以在含抗菌素的培养基中生长。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 接种一个单菌落于50 ml LB培养液中,于37℃摇床培养过夜(250 r/min)。
2. 往一个2 L 的烧瓶中加入400 ml LB培养液,再加入4 ml 过夜培养液,于37℃;摇床,培养至OD590为0.375。 3. 将培养液分装到8个50 ml 预冷无菌的聚丙烯管中,于冰上放置5~10 min,然后于4℃,1 600 g 离心7 min。
4. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,于4℃,以1 100 g 离心5 min 。
5. 细胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬,冰上放置30 min,于4℃,1 100 g 离心5 min。
6. 用2 ml 冰冷的CaCl2溶液重悬各管细胞,然后按每管250 ul 的量分装于预冷的无菌聚丙烯管中,立即冻存于- 70℃。
7. 按照以下各步骤用10 ng pBR322转化100 ul 感受态细菌。 8. 将合适体积的转化物涂于含有氨苄青霉素的LB平板上,37℃培养过夜。 9. 将10 ng 加入到一个15 ml 无菌的圆底试管中,并放置冰上。 10. 将盛有感受态细胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。 11. 立即将100 ul 感受态细菌加 入到管中,轻轻旋动,并放置冰上10 min 。 12. 将管故入42℃水浴2 min 进行热休克,然后加入1 ml LB 培养液于每一支试管中。 13. 于37℃置滚筒式摇床口培养1 h。 14. 将几个稀释度菌液涂布于含合适抗生素的平板上,于37℃培养12~16 h。 |
注意事项 | 1.转化菌涂平板前抗生素的量要足够,涂布细菌时菌量不要太多,培养时间不要超过16小时。否则抗生素会失效,未转化菌也会生长。 2.制备感受态细胞的过程中,每一步操作的动作要轻柔,尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混合器。 3.所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4℃。 4.整个操作过程均应在无菌条件下进行。 |
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 按1:100的比例将过夜培养的菌液如人到新鲜的LB培养液中,于37℃培养至为OD600为0.3~0.4。
2. 加入等体积的2x SS于菌液中,在冰上温和地混匀。
3. 将100 ul 感受恣细菌和1~5 ul DNA加入到一个冰冷的聚丙烯管或玻璃管中,4℃放置5~60 min。
4. 加入0.9 ml 含20 mmol/l 萄糖的LB培养液,37℃温和振荡培养30~60 min 在合适的平扳上挑选转化体。 |
实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
1. 接种一个单菌落于5 ml LB培养液,37℃温和振摇培养5 h 或过夜。
2. 将2.5 ml 培养物加人到盛有500 ml LB培养液的2 L 烧瓶中,37℃摇匀振荡培养至OD600为0.5~0.6。
3. 细菌在冰水浴冷却10~15 min,然后转移到预冷的1升离心瓶中。于2℃,5 000 g 离心20 min 沉淀用5 ml 预冷的水溶解6。
4. 加入500 ml 冰冷的水,混匀,按步骤3重复离心1次,立即将上清倒掉,用残余的液体重悬细胞。
5. 新鲜制得的细菌
(1)将悬浮液加入到预冷的50 ml 聚丙烯管中,2℃,5 000 g 离心10 min。 (2)估计细胞沉淀的体积,沉淀用等体积的冰冷水重悬。 (3)按50~300 ul 分装于预冷的微量离心管中。 6. 冻存细菌 (1)加入40 ml 冰冷的10%甘油,混合,然后按照步骤5离心。 (2)估计沉淀的体积,然后加入等体积的冰冷的10%甘油,重悬菌体。 (3)按50~300 ul 分装于预冷的微量离心管中。 (4)于干冰上冷冻并贮存于-80℃。 7. 将电转化仪调到2.5 kV、 25 uF ,脉冲控制器调到200~400Ω;。 8. 将1 ul 质粒DNA加入到盛有新鲜制备的细菌或融化的冻存细菌的小管中,混匀。
9. 将转化混合物转移到预冷的电转化池中,吸干池的外表面,然后放入样品槽中。
10. 进行脉冲电转化,然后取出电转化池,马上加入1 ml SOC培养液,并且用巴斯德吸管转移到无菌的培养管中。
11. 于37℃,中速振荡培养30~60 min。 12. 分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。 |
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