标签: 免疫荧光 流式细胞仪 制备
流式细胞仪(flowcytometry,FCM)可用于:(1)免疫学的基础研究和临床应用,尤其是结合单克隆抗体技术;(2)在免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫监测;(3)机体免疫状态的监测;(4)免疫细胞的系统发生及特性研究等方面。
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1. 用10% FCSRPMll640 调整细胞浓度为5×106—1×107/ml
2. 取40 μl细胞悬液加入预先有特异McAb(5——50 μl)的小玻璃管或塑料离心管,再加50 μl 1:20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清。
3. 4℃静置30 min。
4. 用洗涤液洗涤2次,每次加洗涤液2 ml,1000 r/min×5 min。
5. 弃上清,加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物,充分振摇。
6. 4℃静置30 min。
7. 用洗涤液洗涤2次,每次加液2 ml,1000 r/min×5 min。
8. 加适量固定液(如为FCM制备标本,一般加入1 ml固定液,如制片后在荧光显微镜下观察,视细胞浓度加入100—500 μl固定液)
9. FCM检测或制片后荧光显微镜下观察,(标本在试管中可保存5——7天)
2. 洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
4. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。
如何选择哪种荧光标记的抗体呢?
我准备做小鼠肝脏淋巴细胞的流式,检测分泌IL-17的淋巴细胞,如CD4+,CD8+,NK1.1,如何搭配抗体的荧光标记呢
1 评论
怎么木有具体步骤呢`?可不可以补充一下呢`?
求具体步骤
该实验关于细胞活性的问题
注意事项第四点细胞活性要好,否则容易发生非特异性染色的原因是什么?因为细胞活性不好,荧光物质会透过膜进去细胞内吗?
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