一、细胞计数
1. 将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。
2. 将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。
3. 静置3分钟。
4. 镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:
细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10 000
注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。
二、细胞活力
1. 将细胞悬液以0.5 ml加入试管中。
2. 加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液,染色2-3分钟。
3. 吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。
4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。
三、MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。
1. 细胞悬液以1 000 rpm离心10分钟,弃上清液。
2. 沉淀加入0.5-1 ml MTT,吹打成悬液。
3. 37℃下保温2小时。
4. 加入4-5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。
5. 1 000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570 nm比色,酸化异丙醇调零点。
注意:MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。
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